文蛤SRBI基因克隆及其在不同壳色群体中的差异表达

崔宝月 董迎辉 赵家熙 胡凌威 李晓英 姚韩韩 林志华

(1. 上海海洋大学水产与生命学院， 上海 201306； 2. 浙江万里学院， 浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室， 宁波315100； 3. 淮海工学院， 江苏省海洋生物技术重点实验室， 连云港 222000)

SRB I (Scavenger receptor class B type I ， B类I型清道夫受体)是B型清道夫受体中的成员之一，作为类胡萝卜素吸收过程的关键基因[1]， 主要是通过介导高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)影响胆固醇酯的选择性吸收进而影响类胡萝卜素在体内的吸收和转运[2]。迄今为止SRBI基因已在家蚕(Bombyx mori)[3]、小鼠(Mus musculus)[4]、仓鼠(Mesocricetus auratus)[5]等模式动物中进行了大量的研究。在海洋贝类中， 仅开展过少量相关研究， 如Liu等[6]通过转录组比对分析， 发现SRB-Like-3基因在华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)橙色个体中表达量高； 雷超等[7]分析了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的B型清道夫受体的基因序列特征， 荧光定量分析发现在鳃、中央膜、闭壳肌、肝胰脏均有表达， 其中肝胰脏中表达量最高。但在文蛤中尚未见到关于SRBI的相关报道。

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的经济贝类之一， 其壳色变异丰富并且可以遗传给后代。已有研究表明， 红壳文蛤外套膜内比其他壳色文蛤含有更为丰富的类胡萝卜素， 并推测类胡萝卜素与壳色形成密切相关[8，9]。目前， 已有多位学者开展了文蛤组蛋白去乙酰化酶1[10]、生长因子受体结合蛋白2[11]、C型凝集素[12]等生长和免疫相关基因的克隆和表达特征分析， 而与文蛤壳色相关的基因尚未见报道。本研究获得红壳文蛤SRBI(Mm-SRBI)基因的cDNA全长以及多段内含子序列， 并分析了它在不同组织和不同壳色群体中的表达差异， 为后续深入研究文蛤壳色形成机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验文蛤材料均取自宁波市鄞州区丹艳养殖基地。随机选择4种壳色(暗纹、白壳、红壳和黑斑)文蛤活体成贝各8枚， 并解剖获得外套膜边缘组织， 液氮速冻， –80℃保存， 样品供以后实验所用。随机选择红壳文蛤10枚， 迅速获取6个组织(斧足、外套膜、水管、鳃、内脏团和闭壳肌)样品， 液氮迅速冷冻， –80℃保存待用。

1.2 实验方法

Mm-SRBI基因cDNA全长克隆用Trizol法提取红壳文蛤外套膜组织的总RNA， 然后用试剂盒(Clontech)合成Mm-SRBI基因cDNA。根据文蛤转录组文库中SRBI基因的EST序列， 分别设计3′和5′端特异性引物SRBIF和SRBIR (表 1)， 用SMART RACE试剂盒(Clontech)扩增Mm-SRBI基因的cDNA全长。PCR产物经电泳检测、割胶回收， 回收产物与T1(Trans)载体连接， 然后转化至大肠杆菌中培养过夜， 挑取白斑摇菌检测， 将阳性结果进行测序。测序结果进行比对和拼接， 得到Mm-SRBI基因的cDNA全长。

为了确保Mm-SRBI基因cDNA全长的准确性，将已经获得的基因的cDNA全长作为模板， 分别设计SRBIF1和SRBIR1为引物(表 1)， 进行扩增和测序， 后续实验同上。

Mm-SRBI基因的序列及进化分析利用BLAST软件将5′-RACE片段和3′-RACE片段序列拼接， 获得Mm-SRBI基因cDNA全长； 使用DNAMAN6.0软件预测其氨基酸序列， 并推测其理化性质； 用ORF Finder搜索Mm-SRBI基因的开放性阅读框；Clustal X进行氨基酸多序列比对； 利用ExPASy软件推测该蛋白理化特性； Smart软件进行蛋白质功能域预测； 利用TMHMM和SignalP分别进行蛋白质跨膜区和信号肽区域分析； 使用软件Swiss Model进行蛋白质高级结构预测； 用Motif Scan搜索工具对SRBI序列进行功能位点检测； MEGA 6.0软件NJ法构建系统进化树。

表 1 本实验所用引物及其序列Tab. 1 Primers and their sequences of the experiments

Mm-SRBI基因在不同壳色和不同组织群体中的表达差异分析取上述4种壳色的外套膜和红壳文蛤的6个组织， 提取RNA之后按照反转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA， 并作为荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板， 用PRIMER设计引物qRT-F和qRT-R (表 1)， 以18SrRNA基因(表 1)为内参， 用ABI 7500fast进行荧光定量PCR。数据处理采用相对值2–ΔΔCt进行计算， 用软件SPSS 17.0进行统计数据得到各个组织和不同壳色群体的差异分析结果。

基因的内含子克隆提取文蛤外套膜的基因组DNA， 根据已获得的Mm-SRBI基因的cDNA序列设计特异性引物进行PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖电泳检测、割胶回收和连接转化， 选取阳性克隆送测序。

2 结果

2.1 Mm-SRBI基因的cDNA全长与序列分析

Mm-SRBI基因的cDNA全长为1676 bp (Gen-Bank登录号: KY434116)， 开放阅读框(ORF) 1515 bp，编码504个氨基酸， 5′-UTR长50 bp， 3′-UTR为112 bp，包含1个终止密码子TGA和25 bp的polyA尾。

2.2 Mm-SRBI基因编码的蛋白结构预测

SignalP软件预测显示， 该蛋白质没有明显的信号肽； ExPASy Protscale软件预测发现， 该蛋白极性氨基酸所占的比例较高， 表现亲水性； ExPASy Compute推导出Mm-SRBI蛋白的理论等电点pI=6.27， 分子量为56.87 kD。TMHMM软件预测在结构域两端有2个跨膜蛋白。功能域预测结果表明，Mm-SRBI蛋白含有1个CD36功能域， 其含有455个氨基酸(14—469 aa)。Swiss model软件预测显示，Mm-SRBI蛋白的二级结构由271个H键、18个螺旋和43个转角组成。

2.3 Mm-SRBI基因与其他物种的同源性比对及进化分析

利用MEGA6.0软件的NJ法构建系统进化树，文蛤和其他10个物种SRBI进行了氨基酸序列比对。结果发现， 文蛤与华贵栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis，AJM13628.1)的同源性最高为55%， 与太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas， XP_011432626.2)、海蜗牛 (Aplysia californica， XP_005103573.2)、囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii， XP_006815324.1)、日本对虾 (Marsupenaeus japonicas， AKO62849.1)、罗非鱼(Oreochromis niloticus， XP_003444373.1)、褐家鼠 (Rattus norvegicus， NP_113729.1)、人 (Homo sapiens， NP_005496.4)、牛(Bos taurus， NP_777022.1)、野猪(Sus scrofa， NP_999132.1)等物种的同源性为34%—51%。从构建的系统进化树中可以看出(图 1)，文蛤与同为无脊椎动物的瓣鳃纲、腹足纲亲缘关系较近， 与哺乳纲、鱼纲和甲壳纲的亲缘关系较远。

图 1 采用MEGA6.0软件NJ法构建的进化树Fig. 1 The NJ phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software

2.4 不同组织和不同壳色群体表达差异分析

qRT-PCR检测结果表明，Mm-SRBI在6个组织中(闭壳肌、外套膜、足、鳃、内脏团和水管)均有表达， 其中外套膜表达量最高， 与其他各组织间存在极显著差异(P＜0.01)(图 2)。Mm-SRBI基因在不同壳色文蛤的外套膜中也均有不同程度的表达， 在壳色较深的黑斑文蛤、红壳文蛤中表达量较高， 而在白壳文蛤中表达量最低， 且它们之间有显著性的差异(P＜0.05)(图 3)。

2.5 Mm-SRBI基因内含子序列分析

Mm-SRBI基因共有13个外显子和12个内含子，序列总长度为9272 bp， 且外显子和内含子的连接处遵循AT/GT原则， 即均属于GT-AG内含子。从序列长度来看， 4号外显子最长为201 bp， 6号外显子最短， 为49 bp， 其余的在51—201 bp； 8号内含子最长，为1020 bp， 6号内含子最短， 为119 bp， 其余内含子长度在396—1001 bp (图 4)。

图 2 Mm-SRBI基因在红壳文蛤不同组织中的表达差异分析(n=3)Fig. 2 The expression of Mm-SRBI gene in different tissues of red shell of M. meretrix (n=3)

图 3 Mm-SRBI基因在不同壳色文蛤外套膜中的表达差异分析(n=3)Fig. 3 The expression of Mm-SRBI gene in shells colors of M.meretrix (n=3)

图 4 Mm-SRBI基因结构图Fig. 4 The structure of Mm-SRBI gene

3 讨论

B类Ⅰ型清道夫是膜受体蛋白， 能高亲和力地结合HDL[13，14]、ox-LDL(氧化修饰低密度脂蛋白)和ac-LDL[5，15](乙酰化低密度脂蛋白)等， 还参与炎症反应、清除凋亡细胞和宿主防御等生理反应[16—21]。目前关于SRBI基因的研究主要集中在哺乳动物和模式动物， 如在果蝇(Drosophila melanogaster)中研究了SRBI基因在类胡萝卜素转运中的生理功能[22，23]、在家蚕中研究了黄茧的形成[19]。本实验首次获得文蛤Mm-SRBI基因的cDNA全长序列1676 bp， 开放阅读框1515 bp， 编码504个氨基酸，这与马氏珠母贝SRB基因的开放阅读框有1443 bp、编码480个氨基酸的结果大致相当[7]。Mm-SRBI蛋白含一个CD36结构域， 编码455个氨基酸(14—469)。Mm-SRBI的CD36结构域包含C端和N端的两个跨膜区(1—29AA和449—504AA)， 一个胞外区， 有多个糖基化、蛋白激酶磷酸化等多种位点， 这与已报道的家蚕[3]和马氏珠母贝[7]B型清道夫受体大致相同， 因此说明Mm-SRBI属于含有CD36结构域的B类清道夫受体家族。

已有研究证明， 类胡萝卜素是维生素A的前体，动物不能从头合成只能从食物中获取[24]。SRBI基因是通过识别与高密度脂蛋白和低密度脂蛋白结合的类胡萝卜素， 并将其转运到细胞[18，19]。已有研究发现，SRBI基因在贝类中参与壳色的形成[8]， 如在华贵栉孔扇贝中发现橘色贝的类胡萝卜素含量高于白色贝， 且与B类清道夫受体基因的高表达相关，通过RNA干扰对该基因下调， 发现血液中类胡萝卜素含量显著降低， 为B类清道夫受体基因与类胡萝卜素累积有关提供证据[6]。本实验通过qRT-PCR技术证明红壳文蛤Mm-SRBI基因在各个组织均有表达， 其中在外套膜的表达量最高； 不同壳色群体之间Mm-SRBI基因的表达量存在着较大的差异， 白壳的表达量较低而红壳却表达量显著。先前的研究证明， 在红壳文蛤外套膜中富含丰富的类胡萝卜素，其含量是白壳文蛤的3倍多[8]。据此推测Mm-SRBI基因参与文蛤类胡萝卜素的转运和在外套膜上的富集， 从而影响红壳色的形成。

大部分真核生物的基因都是由若干个编码区和非编码区组成的断裂基因， 编码区序列为外显子，断裂基因中的非编码区序列为内含子。诸多研究发现， 在生物体有极少数内含子参与了机体内基因表达调节， 如果蝇组织中的长内含子在其两侧外显子， 拼接之前通过共转录参与机体的表达调控[20]；小鼠血小板生成素基因(TPO)的第5内含子， 可以提高TPO的表达[25]； 文蛤长链脂肪酸-CoA连接酶(ACSL)内含子中， 有5个SNP与生长性状显著相关[26]。本研究克隆得到Mm-SRBI基因7596 bp的内含子序列， 分析表明内含子核苷酸序列均符合“GT开头，AG结尾”的原则， 是真核生物RNA剪切的识别位

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