黄颡鱼Wnt家族4个基因的克隆、组织表达及对铜的响应

张丽晗 罗 智 有文静 李丹丹 吴 坤 徐异桓

(华中农业大学水产学院，动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室， 武汉 430070)

Wnt家族的基因最初是由Nusse和Varmus于1982年在鼠类乳腺癌病毒诱导的小鼠乳腺癌中克隆得到的， 并被命名为Int-1， 该基因由于与后来报道的果蝇无翅基因Wingless (Wg)同源， 故将两者合并命名为Wnt[1]。自从Wnt家族在1982年被发现以来， 科学工作者已经陆续在哺乳动物基因组中发现了19种Wnt家族成员基因[2]。进一步的研究证实，Wnt基因家族与其他相关基因组成了一条复杂的信号传导途径——Wnt信号途径(Wnt signaling pathway)。Wnts可以通过经典的Wnt/β-catenin信号通路或者非经典Wnt信号通路(包括Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/PCP信号通路)调节靶基因的表达， 在动物胚胎发育、细胞分化和器官发育等多种生命过程中发挥作用[3—5]。

Wnt通路是机体重要的信号转导通路之一， 在细胞增殖、分化、胚胎发育和卵泡生成方面具有重要的调节作用[6，7]。因此， Wnt信号转导通路的错误调节可导致包括卵巢发育失调在内的多种病理变化[3，8]。研究已证实， 以Wnt基因为配体的Wnt信号通路在进化中非常保守， 从低等的无脊椎动物到高等的哺乳动物都可以明显检测到该信号通路成员的表达[5]。在鱼类， 目前仅在一些模式鱼类克隆得到了Wnt家族部分成员的cDNA序列， 如斑马鱼(Danio rerio)[9，10]和青鳉(Oryzias latipe)[11]等。最近，曹梅等[12]基于斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的基因组数据库， 通过与NCBI中存在的人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus) 和斑马鱼等Wnt蛋白氨基酸序列进行比较， 发现斑点叉尾鮰Wnt基因家族成员共20种。然而， 在其他鱼类， 还没有有关Wnt家族成员cDNA序列克隆的报道， 也没有关于这些基因mRNA组织表达的研究。

铜是包括鱼类在内的所有脊椎动物必需的微量元素之一， 广泛地参与体内的许多生化过程， 然而， 过量的铜对生物体是有毒的[13]。与其他脊椎动物不同， 鱼类可以经由鳃从水中吸收铜。我们前期研究发现水体铜暴露能影响黄颡鱼的卵巢发育和激素分泌[14]， 然而相关机制尚不清楚。对哺乳动物的研究表明， Wnt介导的通路在卵巢发育和激素分泌过程中起着重要作用[15]。Wnt通路能通过激活βcatenin提高FSH的作用效果， 因而促进腔前卵泡的生长， 然而， 过度活化β-catenin对LH激素诱导的排卵和黄体化产生不利的影响[16]。

鉴于Wnt家族基因和蛋白对卵巢发育的重要作用， 我们假设Wnt家族成员介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育和激素分泌的调控。所以， 作为深入解析这些成员功能的第一步， 本研究首先克隆了黄颡鱼Wnt家族4个基因(Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b)全长的cDNA序列， 探讨了它们的组织表达模式； 在此基础上研究了水体铜暴露对这些基因mRNA表达的影响， 为深入研究Wnt家族基因在铜影响鱼类卵巢发育和激素分泌中所起的作用奠定基础， 并为解析鱼类Wnt家族基因的功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

本实验的黄颡鱼为一龄黄颡鱼， 均购自武汉市上涉湖养殖场(东经114°15′， 北纬30°8′)， 分为2组。第一组黄颡鱼用于Wnt家族4个基因cDNA序列的克隆和组织表达水平的测定。用于基因克隆的黄颡鱼组织样品为肝脏和卵巢组织。用于基因表达谱测定的组织包括黄颡鱼的脑、脾脏、肾、鳃、心脏、肌肉、脂肪、肝脏和卵巢组织。取样参照本实验室的方法[17，18]。

第二组黄颡鱼用于检测水体铜暴露对Wnt家族4个基因表达水平的影响。实验策略参照[14]。简单说来， 216尾规格均一的健康黄颡鱼[平均体重:(10.2±0.2) g， 平均值±标准误]随机放入9个300 L玻璃纤维缸中， 每缸24尾。分别暴露在铜浓度为0(对照)、30(低)和60(高) μg/L的水体中， 每个处理设3个重复(即3个缸)， 每天换水1次。水中铜浓度通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定[14]， 每周测定2次， 实测值分别为(3±1)、(31±2)和(62±3) μg Cu/L (平均值±标准误，n=16)。实验期间， 黄颡鱼每天饱食投喂商业饲料2次[饲料Cu含量: (3.1±1) mg Cu/kg， 平均值±标准误，n=3]， 每天换水1次。实验持续8周， 在28d和56d时进行取样， 每缸取6尾黄颡鱼提RNA用于基因表达测定。

1.2 实验药品

RNA提取试剂盒(Trizol Reagent)、逆转录试剂盒、3′-Full RACE Kit试剂盒、5′-Full RACE Kit试剂盒、荧光定量试剂盒、凝胶纯化回收试剂盒、Taq酶、DNA Marker(2000)、dNTP等试剂购自大连宝生物公司(TaKaRa)， 胰蛋白胨和酵母粉购自Sigma公司， 无水乙醇、氯仿、异丙醇等为中国国药分析纯产品。

1.3 Wnt家族基因cDNA序列的克隆

参照本实验室已有的方法[17，18]。简要步骤如下: 总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol说明书进行。总RNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳进行检测， 其浓度及A260/A280通过Nanodrop ND2000分光光度计测定。然后， 以提取的总RNA为模板， 用TaKaRa公司的反转录试剂盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成第一链cDNA。

根据GenBank及Ensembl数据库中已报道的鱼类Wnt家族基因序列， 设计简并引物(表 1)， 以扩增Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因cDNA核心片段。PCR反应程序如下: 94℃预变性4min； 94℃30s， 55℃ 30s， 72℃ 1min， 30个循环； 72℃延伸5min。PCR体系包括500 ng cDNA template、0.2 μmol/L primer、5 μL 10×ExTaqBuffer、2.5 mmol/LdNTP和1.25 U ExTaqpolymerease (TaKaRa， 日本)。然后分别设计3′和5′ RACE特异性引物(表 1)进行巢式PCR反应， Outer-PCR反应参数为: 94℃预变性3min； 然后94℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃ lmin， 共25个循环； 最后72℃再延伸10min。Inner-PCR反应参数为:94℃预变性3min； 然后94℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃1min， 共30个循环； 最后72℃终延伸10min。

1.4 序列分析

用DNAStar软件将扩增得到的核心片段、3′和5′末端序列拼接， 从而获得基因的cDNA全长序列。获得的核苷酸序列经NCBI进行BLAST， 以确定该序列对应的基因亚型(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。同时， 运用DNAStar软件找出开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸序列。序列比对和氨基酸同源性分析使用Clustal-W软件。进化树用MEGA 5.0软件采用邻接法(NJ)构建[19]， 选择的最适进化模型为JTT+G[20]， 每个节点的可信值进行1000次重复计算。

1.5 基因的组织分布和表达分析

参照文献[17， 18]采用实时荧光定量PCR (qPCR)方法检测， 荧光定量引物见表 2。qPCR反应参数为: 95℃预变性30s； 95℃ 5s， 57℃ 30s， 72℃ 30s，共40个循环。相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算[21]。选用双内参(β-actin和gapdh)进行标准化。我们的预实验表明这2个内参组合在黄颡鱼不同组织及不同铜暴露浓度下的表达水平没有显著差异。

表 1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因克隆的引物序列Tab. 1 Primers used for the cDNAs cloning of Wnt5a， Wnt5b，Wnt7a and Wnt9b genes

1.6 数据分析

结果采用平均值±标准误(Mean±SEM) 进行表示。统计分析之前， 采用Kolmogorov-Smirnov检验所有数据的正态分布性。不同处理间方差的同质性使用Bartlett检验。实验处理组之间进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较检验。显著性水平取0.05。采用SPSS 19.0软件(SPSS， Michigan Avenue， Chicago， IL， USA) 进行数据分析处理。

2 结果

2.1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的分子特征及进化分析

本研究通过RT-PCR和RACE方法获取Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全长序列， 长度分别为1984、2905、2158和1622 bp。序列分析显示，它们的cDNA序列ORF长度分别为1124、1124、1049和1073 bp， 翻译成蛋白所得到的氨基酸数分别为375、375、350和358。黄颡鱼除WNT7A以外， WNT5A、WNT5B和WNT9B氨基酸序列都有信号肽酶切位点。黄颡鱼WNT5A和WNT5B都有24个保守的半胱氨酸残基， 4个保守的天冬酰胺残基和1个酪氨酸硫酸化位点(图 1)。黄颡鱼WNT7A蛋白有24个保守的半胱氨酸残基(图 2)。黄颡鱼WNT9B有23个保守的半胱氨酸残基和1个N糖基化位点(图 3)。

多肽序列比对发现黄颡鱼WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B氨基酸序列与其他鱼类和哺乳类的同源性分别为78.6%—83.4%、76.3%—88.4%、85.9%—89.3%和58.9%—85.9%。

黄颡鱼和其他脊椎动物WNTs氨基酸的进化树见图 4。在进化树中， 所有硬骨鱼WNTs独立聚集成一簇， 而两栖类和哺乳类WNTs聚集成另外一簇。与其他硬骨鱼类相比， 黄颡鱼WNT5A与墨西哥丽脂鲤(Astyanax mexicanus) 比较接近， 黄颡鱼WNT9B与青鳉(Oryzias latipe) 最近。黄颡鱼WNT5B与 墨西哥丽脂鲤(Astyanax mexicanus) 和斑马鱼(Danio rerio)比较接近。硬骨鱼类WNT7A先与青鳉(Oryzias latipes)和斑马鱼(Danio rerio) 聚成一簇， 再与黄颡鱼WNT7A共同聚成一簇。

表 2 荧光定量引物Tab. 2 Primers used for real-time PCR

图 1 黄颡鱼(Pf: Pelteobagrus fulvidraco)WNT5A和WNT5B氨基酸序列与斑马鱼(Dr: Danio rerio)、墨西哥丽脂鲤(Am: Astyanax mexicanus)和人类(Hs: Homo sapiens)比对分析Fig. 1 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT5A and WNT5B amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Am: Astyanax mexicanus； Hs: Homo sapiens)

图 2 黄颡鱼(Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT7A氨基酸序列与斑马鱼(Dr: Danio rerio)、青鳉(Ol: Oryzias latipes)和人类(Hs: Homo sapiens)和其他硬骨鱼类比对分析Fig. 2 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT7A amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Ol:Oryzias latipes； Hs: Homo sapiens)

2.2 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的组织表达模式

Wnt5a的mRNA在肌肉表达最高， 其次是脂肪组织， 而在其他组织(如脑、脾脏、肾脏、鳃、心脏、肝脏和卵巢)中无显著差异(图 5A)；Wnt5b在脾脏中的表达最高， 而在其他组织中无显著性差异(图 5B)；Wnt7a在肌肉中表达最高， 其次是脑、卵巢、脂肪和鳃， 而在其他组织中无显著性差异(图5C)；Wnt9b在肌肉中表达最高， 而其他组织无显著性差异(图 5D)。

2.3 水体铜暴露对Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因表达水平的影响

在暴露28d时，Wnt7amRNA水平在30 μg Cu/L组最高， 其他2组差异不显著 (图 6A)。Wnt5a、Wnt5b和Wnt9b基因的mRNA表达各个处理组无显著性差异。在暴露56d (图 6B)，Wnt5b在60 μg Cu/L组最低， 其他2个组差异不显著；Wnt9bmRNA水平在30 μg Cu/L组最高， 其他2组差异不显著。

3 讨论

3.1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的分子特征与进化分析

本研究克隆得到了黄颡鱼Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全长序列。分析这4个基因的蛋白序列发现， 它们具有一些保守的结构域，如N-糖基化位点、信号肽酶切位点和保守的半胱氨酸残基等[22—25]。本研究指出， WNT蛋白富含半胱氨酸， 这些半胱氨酸之间形成的二硫键对其正确折叠非常重要。N-糖基化是Wnt蛋白的一个重要修饰， 它们对Wnt的分泌和行使正常功能至关重要[26]。多肽序列比对发现， 黄颡鱼WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B氨基酸序列与其他鱼类和哺乳类的同源性分别为78.6%—83.4%、76.3%—88.4%、85.9%—89.3%和58.9%—85.9%， 这与在哺乳动物中的报道相近[22，23，27，28]。进化树分析进一步发现，黄颡鱼WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B多肽与其他鱼类的亲缘关系与物种的分类地位相符，与曹梅等[12]在斑点叉尾鮰中的研究结果相似。

图 3 黄颡鱼(Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT9B氨基酸序列与斑马鱼(Dr: Danio rerio)、墨西哥丽脂鲤(Am: Astyanax mexicanus)和人类(Hs: Homo sapiens)比对分析Fig. 3 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT9B amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Am:Astyanax mexicanus； Hs: Homo sapiens)

3.2 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的组织表达模式

研究基因的组织分布模式有助于我们初步了解这些基因的生理功能。Wnt家族成员作为一种信号分子普遍存在于生物体各个组织中， 并参与生物体多种组织细胞的生命过程。然而， 先于我们的研究， 目前在鱼类还没有有关这些基因mRNA组织表达模式的报道。我们的研究表明这4个Wnt基因在黄颡鱼各组织中均有表达， 但不同组织间的表达水平差异很大， 一方面表明Wnt家族的这4个基因在各个组织中起着广泛的作用， 另一方面不同组织差异性的表达模式可能反映了不同组织特有的生物学作用。因此， 这种表达差异被认为是Wnt基因功能的多样性造成的。相似地， 周春娅等[25]指出海蜇Wnt5基因在不同的发育阶段均有表达， 但存在着明显的发育表达差异。此外， 在卵巢中的表达表明这些基因可能在卵巢发育和成熟中起着重要的调控作用， 相似的结果在Sanchez等[15]的研究中得到了证实。

3.3 水体铜暴露对Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因表达水平的影响

图 4 脊索动物Wnts系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree based on the protein sequences of Wnts from P. fulvidraco (▲) and other chordate species using the neighborjoining (NJ) method with 1000 bootstrap replicates

在本研究中， 我们假设铜对黄颡鱼卵巢发育和激素合成的影响与Wnt通路的变化有关。然而， 无论是在陆生(包括哺乳动物)还是水生动物， 目前还没有关于铜影响这些基因表达水平的报道； 而且，目前仅见Wnt5a在哺乳动物卵巢发育和激素分泌过程中所起生物学作用的研究， 没有Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b生物学功能的类似报道， 因此要进行深入的讨论非常困难。我们的研究表明: 在28d时， 黄颡鱼卵巢中的Wnt7amRNA水平在30μg Cu/L组最高， 其他2组差异不显著；Wnt5a、Wnt5b和Wnt9b基因的mRNA表达各个处理组无显著性差异。而在56d，卵巢中的Wnt5b在60 μg Cu/L组最低， 其他2个组差异不显著；Wnt9bmRNA水平在30 μg Cu/L组最高，其他2组差异不显著。Wnt家族成员是一类富含半胱氨酸的分泌型糖脂蛋白， 可以通过经典的Wnt/βcatenin信号通路或者非经典Wnt信号通路 (包括Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/PCP信号通路) 调控机体的生命活动。有限的研究指出， Wnt5a是非经典Wnt信号通路的配体， 在哺乳动物雌性生殖系统发育过程中发挥了重要的作用。过表达Wnt5a能够抑制颗粒细胞的β-catenin信号[29]。Wu等[7]在黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)的研究表明，Wnt4基因的上调和cyp19a基因的下调伴随着卵巢的生长， 说明Wnt信号通路参与并调控卵巢组织的生长与发育。本研究初步发现Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b可能介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育和激素合成的变化， 因此，深入阐明Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b在铜影响黄颡鱼卵巢发育和激素合成中的作用机制， 有助于揭示铜影响黄颡鱼卵巢发育和激素合成的机理， 这将为研究铜的繁殖营养和毒性效应提供一个新的思路。

图 5 黄颡鱼Wnts组织特异性表达分析Fig. 5 The mRNA level of Wnts in the brain， spleen， kindey， gill， heart， muscle， fat， liver and ovary

图 6 第28天和第56天铜暴露对黄颡鱼卵巢中Wnts基因(Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b)mRNA表达的影响Fig. 6 Effect of Cu exposure on the mRNA levels of genes (Wnt5a， Wnt5b， Wnt7a and Wnt9b) in the ovary of P. fulvidraco on days 28 and 56

本研究获取了Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全长序列， 为深入解析它们的功能奠定了基础； 这些基因在检测的9个组织中都有表达，但表达水平相同， 表明它们会以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程； 铜暴露差异性影响了Wnt家族4个基因的mRNA水平， 表明它们的基因功能发生了分化， 并可能介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育的调控。

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