雷公藤红素对小鼠腹腔巨噬细胞极化分型的影响

柳笑彦

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

巨噬细胞对外源刺激具有很强的表型可塑性和异质性。根据表型可将巨噬细胞分为经典激活的M1型(促炎)和选择性激活的M2型(抗炎)。其表型变化是多种炎性反应性疾病发生、 发展和终止的调节因子。而炎性反应和代谢紊乱密切相关。因此， 调节巨噬细胞的表型为治疗慢性炎性反应代谢性疾病提供了广阔的前景[1- 3]。

雷公藤红素(celastrol, Cel)，是一种天然三萜类化合物，是从中国传统药用植物雷公藤根皮中分离出的一种活性成分，在各种实验模型中都表现出了有效的抗感染活性[4- 5]。雷公藤红素对饮食诱导肥胖的小鼠脂肪和肝脏组织中M1/M2巨噬细胞极化分型有影响[6]，但其对小鼠腹腔巨噬细胞极化分型的影响尚不清晰。

本研究以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探讨雷公藤红素对小鼠腹腔巨噬细胞极化分型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：DMEM培养基、胎牛血清和Trizol试剂(Gibco公司)；IFN-γ、LPS、雷公藤红素和牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich公司)；反转录试剂盒(ABI公司)；实时定量PCR试剂盒(Promega公司)；流式抗体APC anti-mouse F4/80、流式抗体PE anti-mouse CD11c、流式抗体APC anti-mouse CD206和流式试剂盒(BioLegend公司)；硫乙醇酸盐培养基(Merck公司)。

1.1.2 动物：6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量18～22 g[中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK(京)2014- 0013]。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养及分组处理：腹腔灌肉汤法(刺激法)分离出小鼠腹腔巨噬细胞。将细胞进行如下分组并给予相应药物处理：对照组(con，不作任何处理)、单纯雷公藤红素干预组(Cel，给予雷公藤红素0.1 μmol/L)、经典激活M1组(IFN-γ+LPS，给予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用)和雷公藤红素干预M1组(IFN-γ+LPS+Cel，先给予IFN-γ 20 μg/L和LPS 100 μg/L共同作用，12 h后，再给予雷公藤红素0.1 μmol/L作用)。无血清饥饿24 h后收样进行后续实验。

1.2.2 实时定量PCR检测Arg- 1、iNOS、CD11c、CD206的mRNA表达水平：用Trizol提取细胞总RNA，测定浓度及纯度后，按反转录试剂盒说明进行反转录并按实时定量PCR试剂盒说明配制PCR反应体系、运行反应程序。以β-actin为内参分析，所使用引物(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.3 流式细胞仪检测M1、M2巨噬细胞相关标志物CD11c、CD206：实验设置组别：A1：对照组(Con)、单纯雷公藤红素干预组(Cel)、经典激活M1组(IFN-γ+LPS)和雷公藤红素干预M1组(IFN-γ+LPS+Cel) 4组细胞混合的对照(blank)。B1～B4：对照组(Con)、单纯雷公藤红素干预组(Cel)、经典激活M1组(IFN-γ+LPS)和雷公藤红素干预M1组(IFN-γ+LPS+Cel)4组细胞的F4/80和CD11c双染。C1～C4：对照组(Con)、单纯雷公藤红素干预组(Cel)、经典激活M1组(IFN-γ+LPS)和雷公藤红素干预M1组(IFN-γ+LPS+Cel)4组细胞的CD11c和CD206双染。取6孔板细胞置于冰上，用含1% BSA的PBS洗两遍，每孔1 mL胰蛋白酶消化。5 min后每孔加等量的DMEM培养基终止消化，将细胞收集至相应已标记好的1.5 mL离心管中，1 000×g5 min离心，弃上清。每管沉淀用含1% BSA的PBS 1 mL溶解，吹打混匀，1 000×g5 min离心，弃上清。弃上清后每管约有100 μL的液体残留，按实验设置组别混好细胞，在残留的含1% BSA的PBS细胞悬液里直接添加流式抗体：B1～B4组每管添加APC anti-mouse F4/80抗体和PE anti-mouse CD11c抗体各1 μL；C1～C4组每管添加PE anti-mouse CD11c抗体和APC anti-mouse CD206抗体各1μL。避光冰上孵育15～20 min。再用含1% BSA的PBS 1 000×g5 min洗两遍，每管细胞用500 μL含1% BSA的PBS重悬，流式上机检测分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组Arg- 1、CD206、iNOS及CD11c的mRNA表达水平变化

各组Arg- 1、CD206、iNOS和CD11c的mRNA表达水平变化(图1)。

单纯雷公藤红素干预组Arg- 1 mRNA表达水平有升高趋势；经典激活M1组Arg- 1 mRNA表达水平有降低趋势(图1A)。加入雷公藤红素后，M1型巨噬细胞的Arg- 1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)(图1A)。

经典激活M1组CD206 mRNA表达水平有降低趋势；经雷公藤红素干预后，M1型巨噬细胞的CD206 mRNA表达水平有升高趋势(图1B)。相较于经典激活M1组，单纯雷公藤红素干预组的巨噬细胞CD206 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)(图1B)。

单纯雷公藤红素干预组iNOS mRNA表达水平有非常显著的降低(P<0.01)；经典激活M1组的iNOS mRNA表达水平则有非常显著的升高(P<0.01)(图1C)。加入雷公藤红素后，M1型巨噬细胞的iNOS mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；相较于经典激活M1组，单纯雷公藤红素干预组的iNOS mRNA表达水平也有非常显著的降低(P<0.01)(图1C)。

A.Arg- 1 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; B.CD206 expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; C.iNOS expressional level of control, Cel, IFN-γ+LPS, IFN-γ+LPS+Cel group; D.CD11c expressional level of control, Cel group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with IFN-γ+LPS group

单纯雷公藤红素干预组CD11c mRNA表达水平显著降低(P<0.05)(图1D)。

2.2 各组F4/80+CD11c+ 细胞比例

雷公藤红素能使M1型巨噬细胞比例降低(X轴为APC标记的F4/80，代表泛巨噬细胞；Y轴为PE标记的CD11c，代表M1型巨噬细胞)(图2)。

2.3 各组CD11c+CD206- 细胞比例

雷公藤红素能使M1型巨噬细胞比例降低；M2型巨噬细胞比例太低，无法染上(X轴为APC标记的CD206，代表M2型巨噬细胞；Y轴为PE标记的CD11c，代表M1型巨噬细胞)(图3)。

3 讨论

近年来，肥胖等代谢综合征和与肥胖相关的代谢性疾病在全球范围内日益增加，已经成为严重影响人们健康、经济和生活的主要问题[7]。慢性低度炎性反应与肥胖和代谢综合征有关，在代谢性疾病的发生发展中起着重要的作用。巨噬细胞炎性浸润就是代谢性疾病炎性反应环境的特点之一[8]。经典激活的巨噬细胞(M1)促进脂肪组织炎性反应和胰岛素抵抗，而选择性激活的巨噬细胞(M2)阻止肥胖和胰岛素抵抗[9]。在这种情况下，调节巨噬细胞的极化，改变M1/M2巨噬细胞的比例，为肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病的治疗提供了新的靶点和思路。本研究显示，雷公藤红素能抑制小鼠腹腔巨噬细胞向M1型极化。

中药活性成分和分子靶点的鉴定是现代药理学的巨大机遇。雷公藤红素就是这样一种最初从中药中鉴别出来的化合物。它是一种三萜甲基化合物，是存在于雷公藤根提取物的药理活性成分，已被证明具有抗炎作用，一般用于治疗炎性反应和自身免疫性疾病。雷公藤红素因其潜在的抗炎和抗癌活性而引起了极大的关注，被认为是从传统中药的植物提取物中分离出来的最有前途的药物分子[10]。雷公藤红素在单核细胞、巨噬细胞、白细胞中等能够抑制脂多糖、干扰素c、双链RNA诱导的炎性反应的各种介质[11]。但其对促炎的M1型巨噬细胞和抗炎的M2型巨噬细胞极化分型的影响尚不清晰。在本研究中，雷公藤红素能促使M1型巨噬细胞相应标志物CD11c、iNOS表达减少，能使M2型巨噬细胞相应标志物Arg- 1表达增加，表明雷公藤红素能通过调节巨噬细胞的极化，改变M1/M2巨噬细胞的比例以发挥抗炎作用。

A.proportion of F4/80+CD11c+cells of control group; B.proportion of F4/80+CD11c+cells of Cel group; C.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of F4/80+CD11c+cells of IFN-γ+LPS+Cel group

图2对照、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各组F4/80+CD11c+细胞比例的比较
Fig2ComparisonofproportionofF4/80+CD11c+cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

A.proportion of CD11c+CD206-cells of control group; B.proportion of CD11c+CD206-cells of Cel group; C.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS group; D.proportion of CD11c+CD206-cells of IFN-γ+LPS+Cel group

图3对照组、Cel、IFN-γ+LPS和IFN-γ+LPS+Cel各组CD11c+CD206-细胞比例的比较
Fig3ComparisonofproportionofCD11c+CD206-cellsofcontrol,Cel,IFN-γ+LPSandIFN-γ+LPS+Celgroup

参考文献：

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