莫西沙星对脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎性反应的影响

李 娜，刘雅琴，张秀冰，李美欣，袁红霞，邱振宇*

(1.锦州医科大学第一临床学院 临床医学系, 辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学附属第一医院感染性疾病科，辽宁 锦州 121001)

巨噬细胞(macrophage，Mφ)是脓毒症中机体的第一道防线[1]。Mφ上的Toll样受体- 4(toll- like receptors- 4，TLR4)为脂多糖(LPS)刺激的主要受体[2]，可通过一系列反应激活核因子 (nuclear factor-κB，NF-κB)信号传导通路[3]。近年发现鞘氨醇激酶1(sphingosine-1-phosphate，SPHK1)参与其中的多个环节，并起到关键的调节作用[4]。故目前认为TLR4及SPHK1可能是脓毒症休克和多器官功能衰竭等疾病发生发展的关键因子。

某些喹诺酮类(quinolones，QNs)具有免疫调节活性[5]。莫西沙星(moxifloxacin，MXF)为四代喹诺酮，目前认为其对免疫系统有激活与抑制的双向调节作用[6]，而对其在巨噬细胞炎性反应的影响研究较少。

故本实验拟采用不同浓度MXF对LPS刺激下的小鼠腹腔巨噬细胞进行作用，观察其对TLR4、SPHK1、NF-κBmRNA和蛋白的表达水平，及细胞上清液TNF-α和IL- 1的分泌水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级昆明小鼠，雄性，6～8 周龄，体质量(18 ± 0.5) g，锦州医科大学实验动物中心提供[SCXK(辽)2014- 0004]。每只小鼠笼中放喂3只，实验前饥饿3 d。

1.1.2 主要试剂：1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；TLR4和NF-κB p65(博奥森生物有限公司)；SPHK1(Abgent公司)；盐酸莫西沙星标准品(拜耳公司)；Super M-MLV反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒(BioTeke公司)；RNase固相清除剂(北京天恩泽基因科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；TNF-α和IL- 1ELISA试剂盒(云克隆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞的分离与纯化及培养：按参考文献[7]报道的方法，提取、分离培养及纯化小鼠腹腔巨噬细胞后，再加入RPMI1640 完全培养基置37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。施加处理因素。

1.2.2 实验分组及给药方法：实验分6组：A组：对照组；B组：500 ng/mL LPS 处理组；C、D、E及F组：分别用8、16、32、64 mg/L MXF 干预组。

将细胞接种于6孔板中和铺有细胞爬片的12孔培养板中，每孔细胞量均为2×105个。将各组细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养2 h。收集6孔板中各组细胞进行基因和蛋白的相关指标检测。12孔板中各组细胞4%多聚甲醛固定20 min，免疫荧光相关指标检测。

1.2.3 Real-time PCR检测TLR4、SPHK1、NF-κB p65的mRNA表达：方法按说明书处理，引物信息如表1。

以参照基因为标准进行相对定量，即Livak法，表达比率=2-△△Ct。△△Ct=(实验组目的基因CT-内参CT)-(对照组目的基因CT-内参CT)。

1.2.4 Western blot检测TLR4、SPHK1的蛋白水平：具体操作按说明书，各组巨噬细胞在LPS刺激后24 h收上清。

1.2.5 ELISA试剂盒检测TNF-α、IL- 1的表达：具体操作按说明书。

1.3 统计学分析

表1 引物设计序列Table 1 Primer sequence

F.forword; R.reverse.

2 结果

2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的培养和鉴定

接种小鼠腹腔细胞4 h后巨噬细胞贴壁。分别于4、8、12和24 h后倒置显微镜下可见细胞主要为圆形或椭圆形，折光度好。应用LPS刺激24 h即可见很多细胞出现明显的伪足或变为梭形(图1，2)。

图1 正常培养巨噬细胞Fig 1 Normal culture macrophages (×100)

图2 LPS刺激24 h巨噬细胞Fig 2 Macrophage induced by LPS for 24 h ours(×100)

2.2 Real-time PCR检测TLR4、SPHK1、NF-κB p65 mRNA表达

正常小鼠腹腔巨噬细胞表达TLR4、SPHK1和NF-κB mRNA的量均较低，LPS刺激后TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA表达明显升高(P<0.001)。和LPS组比较16 mg/L MXF干预组上述指标明显回降(P<0.001)， 而32和64 mg/L MXF组上述指标较LPS组进一步升高(P<0.001；P<0.05)(图3)。

2.3 Western blot法检测不同浓度MXF作用后LPS刺激下巨噬细胞内TLR4、SPHK1和NF-κB的表达

与对照组相比，LPS组及MXF+LPS组巨噬细胞TLR4、SHPK1、NF-κB蛋白表达明显增加(P<0.0001)。和LPS组比较MXF 8、16 mg/L组的TLR4、SHPK1蛋白表达显著降低(分别为P<0.01，P<0.0001)，和LPS组比较MXF 8、16 mg/L的NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.01，P<0.001)，MXF 64 mg/L组NF-κB蛋白表达高于LPS组(P<0.01)。MXF 16 mg/L组对3种蛋白表达的抑制最明显，与其他MXF组比较有显著性差异(P<0.001，P<0.01)。

2.4 ELISA检测细胞因子

与对照组相比，LPS组及C、D、E、F组巨噬细胞TNF-α、IL- 1分泌明显增加(P<0.001)。和LPS组比较MXF 16 mg/L的TNF-α、IL- 1分泌显著受抑制(P<0.01)。

3 讨论

巨噬细胞是机体固有免疫的重要执行者， 在机体抗感染中处于第一道防线。巨噬细胞表面TLR4 是主要的 LPS 识别受体[8]。TLR4激活后通过一系列级联反应，最终使NF-κB 等活化。SPHK是一种鞘磷脂代谢酶，其中SPHK1及其产物S1P广泛涉炎性介质反应及免疫细胞的功能。研究发现，细胞外的LPS和细菌脂蛋白(bacterial lipoproteins，BLP)显著上调SPHK1的表达[4]。SPHK1通过第二信使S1P的作用，参与TLR4信号传导途径，活化3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)/AKT和NF-κB等信号传导[9- 10]，NF-κB 激活后启动免疫和炎性反应相关基因的转录，导致炎性过程升级失控表达大量炎性因子如 TNF-α、IL- 1、IL- 6、IL- 8及黏附分子等[11]，参与内毒素血症、休克和多器官功能性衰竭的发生[12- 13]。

*P<0.000 1 compared with control group；◆P<0.05，▲P<0.001，#P<0.0001 compared with LPS group图3 各组TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA的表达Fig 3 TLR4, SPHK1, NF-kappa B mRNA

groupTLR4 SHPK1 NF-κB control0.42±0.020.32±0.010.29±0.02LPS1.77±0.11*1.12±0.05*1.02±0.06*8mgMXF+LPS1.21±0.11*▲0.88±0.03*▲0.83±0.01*▲16mgMXF+LPS0.75±0.03*▲0.87±0.02*▲0.57±0.03*▲32mgMXF+LPS1.28±0.09*▲1.08±0.03*0.90±0.07*64mgMXF+LPS1.81±0.17*1.50±0.04*▲1.31±0.09*▲

*P<0.000 1 compared with control group；▲P<0.01 compared with LPS group.

A.control; B.LPS; C.MKF 8 mg/L; D.MXF 16 mg/L; E.MXF 32 mg/L; F.MXF 64 mg/L图4 各组TLR4、SHPK1和NF-κB蛋白的表达Fig 4 Protein expression of TLR4， SHPK1，NF-κB

groupTNF-αIL-1control20.9±7.6#29.0±9.6#LPS398.0±15.0*168.9±8.6*8mgMXF+LPS329.2±23.3*#121.3±7.3*#16mgMXF+LPS160.8±25.0*#78.8±10.5*#32mgMXF+LPS423.1±37.1*173.2±12.7*64mgMXF+LPS509.8±21.3*#220.3±9.6*#

*P<0.000 1 compared with control group；#BHP<0.01 compared with LPS group.

理论上推断QNs类抗菌药作用于转录因子的方式是药物可能直接作用于细胞膜、细胞受体或真核细胞的核或各种传导通路中的激酶。研究表明，QNs可以提高致死性脂多糖所造的严重脓毒症模型小鼠的生存率。药物结构分析认为某些QNs喹啉环N1位上连接的环丙烷是调节细胞因子的合成活性基团[14]。MXF、环丙沙星、加替沙星、司帕沙星等均有该结构，在治疗剂量就能影响TNF-α、IL- 1、IL- 6 和趋化因子等细胞因子的合成，有抑制促炎细胞因子的作用。Purswani等研究表明，MXF能够通过下调TNF-α或IL- 12，或通过上调IL- 10，调节肺泡巨噬细胞和外周血单核细胞的炎性反应[14]。 但目前很少有证据说明药物可以直接与相应细胞受体(如TLR4)发生作用或直接作用于各种激酶。

在本实验中，不同浓度MXF作用细胞后，对TLR4和SPHK1的表达有不同的影响，在低中等浓度(16 mg/L)时对TLR4和SPHK1的表达有明显抑制作用，而在高浓度(32 mg/L)时则对其表达影响不大，当浓度达到更高(64 mg/L)时对TLR4、SPHK1的表达有一定的刺激作用，对细胞分泌促炎因子TNF-α、IL- 6的影响也是同样，与报道MXF有双向免疫调节作用相符[15]。抗菌药在临床的应用十分广泛，随着对抗菌药物的免疫调节作用研究的不断深入，如果抗菌药不仅限于抗菌治疗，还能有助于重症感染性疾病免疫功能的改善，在临床上将起到事半功倍的效果。

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