160例非人源细胞系的种间交叉污染情况分析

卞晓翠，杨振丽，左春霞，周芳颖，刘玉琴*

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 1.病理学系；2.细胞资源中心， 北京 100005)

在生命科学和医学领域，细胞系是进行分子水平、细胞水平及动物实验研究重要实验材料。细胞系的交叉污染无疑会造成实验结果不可重复，甚至导致结论的错误。2010年公布了360种被交叉污染或错误认定的人源细胞系，种间交叉污染占9%(33/360)[1]。细胞种属鉴定是排除种间交叉污染的重要内容，常见的检测方法有染色体分析、同工酶分析、DNA条码(DNA barcode)测序以及PCR法。早在2009年，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(简称北京协和细胞资源中心)针对常见的哺乳动物细胞系，创建了PCR检测细胞来源种属的方法[2]。该方法操作简单， 结果稳定， 自创建来已经累计检测细胞系1 000余株次。同时，本单位作为国家实验细胞资源共享服务平台的依托单位，也将该方法推广到其他细胞资源保藏中心，包括武汉大学中国典型培养物保藏中心和中国食品药品检定研究院等单位，还为生物医药企业的细胞质控提供了服务。对于人源细胞交叉污染的情况，本中心已有报道，本文主要研究非人源细胞的情况。

1 材料与方法

1.1 样品收集

为160例非人源细胞，均由本中心于2008—2016年收集，中心入库质控或其他单位和实验室委托质控的样品。部分细胞目录见表1。所有细胞在培养和传代过程中收集细胞团，-20 ℃保藏。

1.2 基因组DNA的提取

细胞基因组DNA的提取按照试剂盒(PureLink®Genomic DNA Mini Kit, K1820- 02, Invitrogen公司)说明书进行，通过Nanodrop2000检测提取DNA的浓度和质量。

1.3 种属鉴定

采用先前建立的PCR法进行种属鉴定，其敏感性、特异性及具体方法已报道。简言之，针对人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、牛、狗、猪及兔等10个种属设计特异性的引物；将样本基因组DNA分别用这10种引物进行扩增，然后通过琼脂糖电泳检测扩增产物，观察是否有特异性条带出现，从而判断样品的来源种属。PCR反应同时设立阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照模板，分别以细胞系RD(人横纹肌肉瘤细胞)、Hepa 1- 6(小鼠肝癌细胞)、PC- 12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、 MDBK (牛肾细胞)、MDCK(狗肾细胞)、VERO(非洲绿猴肾细胞)、LLC-PK1(猪肾细胞)、BHK- 21(叙利亚仓鼠肾细胞)和CCC-SMC- 1(兔主动脉平滑肌细胞)作为相应种属的阳性对照模板。PCR程序为: 95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共26个循环; 72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察拍照。

1.4 染色体分析

对本中心收集的PCR法鉴定种属有误的细胞，重新复苏，通过染色体分析确定细胞的来源种属。具体做法为：待细胞培养至对数增殖期，加入终浓度为0.01 mg/L的秋水仙素，37 ℃孵育2 h；去除含秋水仙素的培养液，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，使细胞变圆，脱离培养瓶壁，加入含血清的培养液终止消化；1 000 r/min离心、收集细胞；弃上清，用5～10 mL的0.075 mol/L的氯化钾溶液重悬细胞团，37 ℃作用10～20 min；离心，弃上清，加入2～5 mL新鲜配制的固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1混合)，混匀，室温下固定5～10 min；重复固定细胞2～3次；离心，收集细胞，用少量新鲜固定液重悬；用吸管滴加悬液到干净的载玻片上，使细胞悬液在载玻片上铺展开来，室温下自然干燥；用Giemsa染液染载玻片10～15 min；流水冲洗载玻片，空气干燥。油镜下观察中期染色体并拍照和计数。

表1 研究中使用的细胞系Table 1 List of the cell lines tested

2 结果

2.1 160例非人源细胞系概况

收集到的160例非人源细胞，涵盖9个种属，包括小鼠源细胞97种、大鼠源细胞27种、中国仓鼠细胞4种、叙利亚仓鼠细胞3种、猴源细胞10种、牛源细胞7种、兔源细胞5种、狗源细胞2种及猪源细胞5种(图1)。

图1 160例非人源细胞种属公布Fig 1 Overview of the 160 non-human cell lines tested

2.2 非人源细胞系种间交叉污染的情况

在这160例非人源细胞中，发现154株非人源细胞经种属鉴定与预期一致，排除种间的交叉污染，部分细胞种属鉴定的结果(图2)。另外，有6种细胞存在种间交叉污染的情况，发生率为3.75%。这6种细胞包括H9C2(2- 1)-Luc2-TdT(荧光素酶-红色荧光蛋白标记的大鼠胚胎心肌细胞)、RGC- 5(大鼠视网膜神经节细胞)、Marc- 145(猴肾细胞)、AtT20(小鼠垂体瘤细胞)、ST(猪睾丸细胞)和IPEC-J2B(猪小肠上皮细胞)(表1)。H9C2(2- 1)-Luc2-TdT来源于大鼠胚胎心肌细胞H9C2(2- 1)，但是不同于母系细胞单一的成肌细胞样，该细胞在镜下显示出两种明显不同的形态——成肌细胞样和上皮样(图2)。通过PCR种属鉴定，发现该细胞是大鼠细胞和人源细胞的混合培养物(图2)。后经STR检测，发现混入的人源细胞为SV40T转化的人胚肾细胞293T。在检测发现的6株种内交叉污染的动物细胞中，有3株是来自于同一个兽医学实验室，包括Marc-145(猴肾细胞系)、IPEC-J2B(猪小肠上皮细胞)和ST(猪睾丸细胞)，这3种细胞经鉴定分别为叙利亚仓鼠源细胞、人源细胞和猴源细胞(图2)。其中IPEC-J2B后经STR鉴定发现实为CW- 2细胞，一种人结肠癌细胞系。另外，小鼠垂体瘤细胞AtT20被鉴定为大鼠源细胞，大鼠视网膜神经节细胞RGC- 5经鉴定为小鼠源细胞(表2)。

表2 种间交叉污染的非人源细胞系

2.3 染色体分析结果

在6例出现种间交叉污染的细胞中，仅小鼠垂体瘤细胞AtT20为本中心保藏细胞，其余5例均为其他实验室送检细胞，送检样品为-20 ℃冻存的细胞团，故无法进行进一步的染色体分析。为了确认本中心原来保藏的AtT20的种属，制备了该细胞的染色体铺片。经计数，发现该细胞的染色体分布在65～71条，染色体形态不符合小鼠端着丝粒染色体的特征，为大鼠来源(图4)。

3 讨论

细胞系交叉污染是指一种细胞被另外一种不相关的细胞污染，20世纪50年代首次报道。但是，由于重视程度不够，近些年细胞系交叉污染的现象仍然非常严重[3- 5]。细胞系交叉污染主要是操作者的问题。不同细胞共用培养基、同时操作多种细胞、错误标记或者标记不清以及饲养层细胞或条件性培养基的使用都可能会导致细胞系的交叉污染。有些交叉污染可能出现的比较早，即在细胞系建立的过程就出现了，比如人脐静脉内皮细胞ECV304，其建系实验室保存的细胞就已经被人膀胱癌细胞T24所污染[6]。有的交叉污染可能局限在某些实验室的， 建系的实验室或者大的保藏机构仍能找到的正确的细胞。本研究中发现的6种错误细胞均是这种情况。

T.test sample; P.cell lines of corresponding species used as positive control separately; P1.RD (human rhabdomyosarcoma cell line); P2.Hepa 1-6 (mouse hepatocarcinoma cell line); P3.PC- 12 (rat phaeochromocytoma cell line); P4.CHO (Chinese hamster ovary cells); P5.MDBK(bovine kidney cell line); P6.MDCK(dog kidney cell line); P7.VERO(African green monkey kidney cell line); P8.LLC-PK1(pig kidney cell line); P9.BHK- 21(Syrian hamster kidney cell line); P10.CCC-SMC- 1(rabbit aortic smooth muscle cells); M.DNA marker

图210个种属细胞的PCR检测电泳图
Fig2GelelectrophoresisofthePCRproductsfrom10species

但是，一份针对483名细胞使用人员的调查结果显示，35%的人使用细胞时是从其他实验室获得的，而非正规的细胞保藏机构，且受试者中近一半不会对拿到的细胞进行身份认证[7]。这就使得那些局限在某些实验室的错误细胞得到了推广。

A.two distinct morphology was found in the microscopic view of H9C2(2- 1)-Luc2-TdT; B.the microscopic view of normal H9C2(2- 1); C.by PCR-based species identification, H9C2(2- 1)-Luc2-TdT was cross-contaminated with human cells; D,E.by PCR-based species identification, Mac- 145 and IPEC-J2B were identified as cells of Syrian hamster and human origin, respectively

图3种间交叉污染的非人源细胞系

Fig3Interspeciescross-contaminationofnon-humancells

Rat chromosomes were found in the metaphase spreads of AtT20(mouse pituitary cells)图4 AtT20细胞中期染色体形态Fig 4 Chromosome morphology in the metaphase spreads of AtT20(×1 000)

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是人源细胞身份认证的金标准[8]。国家实验细胞资源共享服务平台负责人同步撰文，告知研究用细胞的质量要求[9]。本中心通过STR对进行细胞身份鉴定时发现联合种属鉴定可以提高细胞交叉污染的检出率。国内常用的482例人肿瘤细胞中，20.5%(99/482)为错误细胞系，其中14.5%为种内交叉污染，4.4%为种间交叉污染，另有1.7%的细胞实为两种细胞混合培养物[10]。非人源细胞交叉污染的比例低于人源细胞的污染比例。国际细胞系认证委员会(International Cell Line Authentication Committee，ICLAC)最新公布的数据中，有488例实验细胞被交叉污染或错误认定，其中非人源细胞占4.9%(24/488)(http://iclac.org/databases/cross-contaminations/)。低污染比例与非人源细胞的使用较少有关。

通过种属鉴定和人源细胞的STR分析，细胞的身份可以得到初步的验证。但是仍需要开发更多的技术来完善，比如小鼠、大鼠等常见动物细胞的STR分析，用于排除种内的交叉污染[11]。另外，通过高通量RNA测序的方法，发现多种鼻咽癌细胞如CNE- 1和CNE- 2等是被Hela细胞与另外一种未知的细胞融合而产生的错误细胞[12]。细胞身份认证仍有大量的工作需要完成。但是，对于实验细胞的使用者来说，从正规途径获取细胞和严格执行无菌操作是避免细胞交叉污染的有效方法。

参考文献：

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[6] Dirks WG, MacLeod RA, Drexler HG. ECV304 (endothelial) is really T24 (bladder carcinoma): cell line cross- contamination at source[J].InVitroCell Dev Biol Anim, 1999,35: 558- 559.

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