健脾益智法对AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平影响的研究❋

邱佳慧，纪立金

(福建中医药大学中医学院，福州 350122)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以持续性认知功能衰退为表现的进行性脑退化疾病。近年来，各项研究均佐证了脾脑相关理论，如强脾补精化瘀益智法组成的强脾补精化瘀益智胶囊具有提高学习记忆能力的作用[1]，可保护胆碱能神经元，同时利于受损神经元的再生修复，进而治疗AD[2]。钱会南[3]等研究发现，应用调理脾胃之方对癫痫、痴呆、抑郁症等神志病都有良好的防治效果。P物质(substance P，SP)广泛分布于中枢及消化系统中，是发挥相应生理作用的脑肠肽。认为SP是脾(肠、胃)脑共同的物质基础，推测SP与脑、脾胃之间存在双向调控，是脾脑相互作用的媒介。健脾益智法是以健脾为主，少佐补精化瘀祛浊，达生志益智除呆之目的的治疗方法。本实验以AD大鼠为载体，以其空间学习记忆能力及海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平为研究对象，探讨健脾益智法对其空间学习记忆能力改善情况，对AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平的影响及其关联，挖掘脾脑相关理论的微观机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级7周龄SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(250±10) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(动物许可证号SCXK(沪)2012-0002)。

1.2 药物

以健脾益智法为组方原则，按人参10 g、黄芪20 g、白术20 g、制何首乌15 g、菖蒲6 g、远志6 g、水蛭3 g比例组成，制备成健脾益智混悬液(0.5 g/ml)。

1.3 试剂及仪器

试剂：Aβ1-40(Sigma、A1075)，PBS (1×)、10%水合氯醛、碘伏、75%酒精、0.9%氯化钠注射液、无水乙醇、即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)试剂盒(博士德，SA1020)、DAB显色试剂盒(黄)(博士德，AR1022)、黏附载玻片、显微镜盖玻片、Anti-Substance P antibody(ab14184)、多聚甲醛。仪器：脑立体定位仪、微量注射针、Morris水迷宫、-80℃超低温冰箱、电热恒温鼓风干燥箱、生物组织烤片机、石蜡切片机、Olympus显微镜。

2 方法

2.1 制作AD大鼠模型

参考唐军等方法[4]制作AD大鼠模型，其中Aβ1-40溶液注射区域为右侧海马齿状回背侧细胞，注射坐标参考包新民脑立体定位图谱。造模后4周，借助行为学检测判断AD造模是否成功。

2.2 分组灌胃给药

采用随机数字表法将40只清洁级SD大鼠分成4组，造模4周后剔除造模失败和术后死亡的大鼠，假手术组6只，模型对照组7只，中药组10只，西药组8只，开始为期4周每日1次的灌胃。中药组给予健脾益智混悬液(14.4 ml/kg/d)，西药组给予吡拉西坦混悬液(14.4 ml/kg/d)，其他组给予等量0.9%氯化钠溶液(14.4 ml/kg/d)。大鼠给药剂量按《中药药理研究方法学》所提供的“实验动物与人按体表面积等效剂量换算比率表”倍数折算。

2.3 Morris水迷宫实验

通过Morris水迷宫的定位航行实验和空间探索实验，反映学习和记忆的基本情况。

Morris水迷宫实验历时5 d，前4 d是定位航行实验，即每天于固定时段将大鼠面对池壁，分别从4个不同入水点放入水中，进行寻找水下平台训练，由录像系统记录大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期。第5天是空间探索实验，即撤除原水下平台，随机择一入水点将大鼠面对池壁放入水中，由录像系统记录大鼠在最大潜伏期内的跨越平台次数。

2.4 免疫组化方法检测大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平

Morris水迷宫实验结束后，麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取脑、大肠石蜡包埋、切片，采用免疫组化法测定大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP的表达水平。光学倒置显微镜高倍(10×20倍)下随机选取3个视野，通过图像分析软件Fiji进行平均光密度检测，取平均值作为检测值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 Morris水迷宫实验结果

表1显示，定位航行实验中与模型对照组、西药组比较，中药组逃避潜伏期明显降低(P<0.05)，与假手术组比较，模型对照组逃避潜伏期明显升高(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。空间探索实验中，与模型对照组比较，中药组、西药组跨越平台次数明显升高(P<0.05)，与假手术组比较，模型对照组跨越平台次数明显降低(P<0.05)，其余组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明健脾益智混悬液可明显缩短逃避潜伏期，明显增加跨越平台次数，西药吡拉西坦仅能明显增加跨越平台次数。

表1 各组大鼠逃避潜伏期(s)和跨越平台次数(次)比较

注：与假手术组比较：aP<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05；与西药组比较：cP<0.05

3.2 各组大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP免疫组化实验结果

表2图1显示，与假手术组、模型对照组、西药组比较，中药组海马区脑肠肽SP表达水平明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，西药组海马区脑肠肽SP表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。表2图2显示，与模型对照组、西药组比较，中药组大肠区脑肠肽SP表达水平明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，西药组大肠区脑肠肽SP表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。由此说明，健脾益智混悬液可上调AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平，西药吡拉西坦不能上调AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平。

表2 各组大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平比较

注：与假手术组比较：aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组比较：cP<0.01；与西药组比较：dP<0.01

图1 各组大鼠海马区脑肠肽SP的表达(DAB显色)注：图1中箭头所示之处为典型阳性表达区域，属海马组织的CA1区

图2 各组大鼠大肠区脑肠肽SP的表达(DAB显色)注：图2中箭头所示之处为典型阳性表达区域，属升结肠组织的黏膜层

4 讨论

健脾益智法通过健脾胃，利用机体脾脑关系，间接益智为主，辅以益智中药直接益智，间接与直接双管齐下，以达疗效。AD的病理是以脾虚为核心，兼以精亏、浊瘀，治疗当以补脾益智为主，与健脾益智法旨意相合，认为健脾益智法是治疗AD的有效治法。本研究创建健脾益智混悬液，方中人参10 g、黄芪20 g、白术20 g为君，甘温入脾，大补脾气，辅以何首乌15 g补益肾精，石菖蒲6 g化浊开窍，远志6 g安神兼以化浊，水蛭3 g活血化瘀。

SP广泛分布于中枢及周围神经系统，能调节神经元活动，发挥着神经递质和神经调质的作用[5]。另外，SP是良好的血管舒张剂，增加血流量，增强脑代谢，并可抑制AD病理学标志β-淀粉样蛋白的效应[5]81，进而改善AD脑部病变。由此认为，SP能延缓AD病理标志老年斑的病理进展。消化系统中，SP对胃肠道大部分平滑肌具有很强的刺激效应，引起收缩并促进胃肠蠕动。SP可激活胃肠道胆碱能神经元，并增加乙酰胆碱效应。SP对胃肠道有上皮保护和促进黏膜愈合的重要作用，可促进大小肠水和电解质的分泌，抑制小肠的吸收[5]79。上述SP生理作用，提示SP是消化系统功能、形态的物质保障。由此可知，SP可作为脾(肠、胃)功能状态和AD进展的评价指标，是脾脑共同的物质基础，推测其是脾脑相互作用的媒介。

本研究采用Morris水迷宫实验，结果显示健脾益智混悬液可明显缩短逃避潜伏期及明显增加跨越平台次数。从宏观层面佐证了健脾益智法可提升AD大鼠空间学习记忆能力，肯定了健脾益智法治疗AD的疗效，为临床治疗AD提供了新思路。微观层面，本研究采用免疫组化方法，研究健脾益智法对AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平的影响及其关联。结果显示，健脾益智混悬液可同步上调AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平。认为健脾益智法可同步上调海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平。综上所述，可知健脾益智法同步提升AD大鼠空间学习记忆能力和AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平。因为脑肠肽SP在中枢及消化系统的双重分布，并发挥相应生理作用，所以认为AD大鼠空间学习记忆能力的提升与AD大鼠海马区、大肠区脑肠肽SP表达水平的提升有关，推测脑肠肽SP是健脾益智法治疗AD的微观作用靶点，即健脾益智法通过同步提高脑肠中脑肠肽SP的表达水平，同步改善脾脑状态，其中借助海马区脑肠肽SP表达水平的提高及其中枢的生理作用，如调节神经元、充当递质和调质、增强脑代谢、抑制β样蛋白效应，使治疗AD起效，为健脾益智法治疗AD提供实验依据。但由于实验动物样本量有限，致实验仍存在局限性，以及脾脑相关理论的微观机制尚未完全阐明，本课题组将继续进行相关研究。

参考文献：

[1] 纪立金,张美增. 强脾补精化瘀益智胶囊治疗多发梗塞性痴呆的疗效观察[J]. 福建中医学院学报,2004，14(5):1-3.

[2] 邵彦,纪立金. 健脾益智胶囊法对AD大鼠血清中AchE及海马区GFAP的影响[J]. 中华中医药杂志,2012，27(7):1919-1921.

[3] 钱会南,王洪图,齐治家,等. 调理脾胃复方对PTZ点燃大鼠神经肽含量的作用[J]. 中国中医基础医学杂志,1998(4):23-25.

[4] 唐军,徐海伟,周光纪，等. ES细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后的分化及对学习记忆的改善[J].第三军医大学学报,2007,29(2):108-111.

[5] 王韶轩.脑肠肽与消化及神经系统基础与临床[M].济南:山东大学出版社,2010：78.