通络治痹汤对兔膝骨关节炎软骨形态改变和炎症因子IL-1β、TNF-α水平的影响❋

李广广，马 勇，郭 杨，戴国达，蔡建平，黄桂成△

(1.南京中医药大学骨伤研究所， 南京 210029； 2.无锡市中医医院，江苏 无锡 214000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节疾病，是导致中老年患者残疾的主要原因之一[1]，它以软骨破损、骨赘形成及滑膜炎性改变为主要病理表现[2]。随着人口老龄化的发展，OA将极大地加重社会医疗负担[3-4]。OA的病因病机复杂多样，现代医学难以准确阐明。目前对OA的治疗以缓解疼痛、抗炎等控制症状为主，且长期服用会带来诸多不良反应[5]。中医药对OA治疗具有疗效全面和安全可靠的独特优势。

蔡建平主任医师从医多年，结合自身临床经验创立经验方通络治痹汤，该方具有祛风除湿、化瘀通络之功效[6]，临证中常以该方加减治疗膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)疗效显著[7]。为进一步研究该方的作用机制，本研究通过改良Hulth法构建兔KOA模型[8-9]，观察通络治痹汤能否抑制KOA兔模型炎症反应并对软骨产生的修复作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康成年新西兰白兔24只，体质量2.0～2.5 kg，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供(许可证号SCXK(苏)2012-0008，合格证号201611476)。依据随机分配原则分为假手术组(A组)、模型组(B组)、藤黄健骨丸组(C组)及通络治痹汤组(D组)各6只。

1.2 主要试剂及仪器设备

苏木素染液、伊红染液，IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒(南京建成科技有限公司)；石蜡切片机(Leica，RM2245)；组织包埋机(Leica，EG1150H/C)；生物显微镜(Leica，：DM1000)。

1.3 模型建立

对A组的新西兰白兔，打开关节腔后直接缝合。其余各组予以改良Hulth法建立膝骨关节炎模型。术后连续5 d，庆大霉素0.4MU/d臀大肌肌注，预防感染。

1.4 药物制备及干预处理

依据《中药药理研究方法学》剂量估换计算公式：dB=dA×KB/KA[10]，将成人每日服药量(通络治痹汤组成：红花、地鳖虫、地龙、独活、川芎、白芥子、牛膝、徐长卿、五加皮、鸡血藤；藤黄健骨丸，国药准字Z20026563，均由无锡市中医医院药剂科提供)折算为实验兔每日服药量。将通络治痹汤煎煮浓缩、藤黄健骨丸研磨溶于水，并定容为10 ml/kg·d-1。造模成功后，C组与D汤组分别给予10 ml/kg·d-1药物溶液灌胃，A组与B组分别给予10 ml/kg·d-1生理盐水灌胃，持续8周。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 Lequesne MG膝关节评估级别 观察实验兔膝关节局部疼痛刺激反应、步态改变、关节活动以及关节肿胀情况，并应用Lequesne MG膝关节评估方法[11]予以评价。

1.5.2 大体形态及组织学观察 治疗结束后，解剖各组实验兔右侧膝关节，肉眼观察关节软骨光滑度、色泽、表面是否有糜烂及溃疡等。用刀片切取股骨内侧髁软骨，4%多聚甲醛固定后制作石蜡切片，苏木精-伊红染色(HE染色)，光镜下观察后行Mankin’s评分[12]。

1.5.3 酶联免疫吸附检测 颈总动脉取血20 ml，静置2 h后离心(4 ℃，2000 r /min，30 min)获得兔血清，分装于Eppendorf管中，-80 ℃保存。

耳缘静脉麻醉后，沿右膝髌上囊剪开约0.5 cm切口，1 ml生理盐水分3次灌洗关节腔，收集关节液置于Eppendorf管中，离心(4 ℃，4000 r /min，10 min)后获取上清液，-20 ℃ 保存。按照酶联免疫检测试剂盒使用说明书分别检测实验兔血清及关节液中IL-1β与TNF-α的含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 Lequesne MG行为学观察

表1显示，与A组比较其余各组Lequesne MG评分显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组及D组评分均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 新西兰白兔Lequesne MG膝关节评估级别

注：与假手术组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05。Kruskal-Wallis分析结果：局部反应=17.882，P=0.0009；步态改变=16.419，P=0.001；关节活动=16.480，P=0.001；关节肿胀=14.987；P=0.002

2.2 软骨大体形态观察

图1所示，兔膝关节A组软骨表面光滑，色泽明亮呈淡粉色，未见裂纹、纤维化及软化等，软骨边缘整齐，无骨赘形成(图A)；B组软骨表面凹凸不平，色泽灰暗无光，可见局部裂纹及纤维化，软骨边缘毛糙，有骨赘形成(图B)；C丸组软骨表面略粗糙呈蓝白色，内外侧髁处可见局部纤维化，内侧髁底部可见局部溃疡，软骨边缘有轻微骨赘形成(图C)；D组软骨表面略毛糙，颜色介于淡粉色与蓝白色之间，内侧髁处粗糙，外侧髁不明显，局部可见裂纹及软骨软化(图D)。

图1 各组关节软骨大体观察图注：A.假手术组；B.模型组；C.藤黄健骨丸组；D.通络治痹汤组

2.3 软骨组织学观察及Mankin’s评分

图2显示，A组软骨表面光滑，细胞排列规则，层次有序，分布正常，染色正常，潮线清晰(图A)；B组软骨表面破损，软骨层大片脱落未见软骨，潮线模糊、断裂(图B)；C组软骨面率粗糙，软骨层小部分缺失，软骨细胞群集现象减轻、排列轻微紊乱，潮线染色较浅，轻度失染(图C)；D组软骨面略毛糙，软骨层局部修复，软骨细胞局部群集、深染，潮线轻度模糊(图D)。

表2显示，软骨组织Mankin’s评分显示，与A组比较其余3组评分均明显增高(P<0.05)，与B组比较，C组及D组评分均明显下降(P<0.05)。

2.4 ELISA检测IL-1β、TNF-α表达

表2显示，对实验兔血清及关节液中IL-1β及TNF-α水平进行ELISA检测后，与A组比较，其余3组的IL-1β及TNF-α水平明显升高(P<0.05)。血清中D组与B组比较，IL-1β及TNF-α水平均明显降低(P<0.05)，C组仅TNF-α水平较模型组有明显改变(P<0.05)。而关节液中C组与D组的IL-1β及TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。

图2 各组关节软骨HE染色(100×)光镜观察图注：A.假手术组；B.模型组；C.藤黄健骨丸组；D.通络治痹汤组

表2 各组关节软骨Mankin’s评分结果及ELISA检测IL-1β、TNF-α水平比较

注：与假手术组比较：#P< 0.05；与模型组比较：*P< 0.05

3 讨论

OA属于中医骨痹范畴。《素问·长刺节论》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”关节疼痛、麻木不仁、难以屈伸是OA的常见表现。如《素问·痹论》：“痹在于骨则重……在于筋则屈不伸。”蔡建平认为“肝肾不足、经络痹阻”是OA的根本病机，但OA发病时患者疼痛难忍，严重影响生活质量，因而标本兼治，以“祛风除湿，化瘀通络”为治则，拟方通络治痹汤。方中地鳖虫化瘀通络、消肿止痛；独活祛风除湿、通痹止痛共为君药；配川芎祛风止痛、活血行气；红花活血通经、祛瘀止痛；鸡血藤养血活血补血、止痛舒筋活络；五加皮祛风湿、补肝肾、强筋骨，四者共为臣药。佐以徐长卿祛风除湿、温经通络，白芥子豁痰利气、散结通络止痛，地龙通经行络，牛膝活血通经、补肝肾、强筋骨，引诸药下行，诸药合用共奏祛风除湿、化瘀通络、培补肝肾之效，对OA患者关节僵硬、酸痛等症状有标本同治之妙。藤黄健骨丸是国医大师刘柏龄教授多年的临床经验总结所制成的中药复方制剂，在治疗OA的临床应用中效果显著，因而被选为阳性对照药物。

关节软骨的退化与损伤是导致OA发生的首要因素。OA发生时软骨退化或损伤将改变软骨表面，关节软骨因而受力异常进而刺激软骨细胞等发生炎症反应，产生大量炎症因子如IL-1β、TNF-α等[13]。临床研究发现，在OA患者的关节软骨组织及滑液中，IL-1β、TNF-α水平明显增高[14]。同时IL-1β与TNF-α是诱导软骨细胞降解的始动因子，能够刺激基质金属蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖(ADAMTS)等组织破坏酶的产生，导致软骨细胞肥大及细胞终末分化等细胞异化作用直接参与对软骨的破坏[15]。实验研究发现，细胞的异化活动将导致细胞基质重建，软骨构成物丢失，软骨钙化、龟裂并引起软骨细胞增殖、群集，从而导致软骨面更加粗糙，软骨厚度变薄及纤维化[16]。因此课题组认为，关节软骨退化与炎症因子是OA发生的2个主要原因，且两者互为因果，不断刺激OA的发生发展，使病情持续恶化，最终导致关节僵硬、功能障碍。

既往研究认为，OA的发生是由抗炎因子与促炎因子的失衡导致，局部组织中炎症因子增多引起软骨退变[17]，过多地肯定了炎症因子的作用，而忽视了软骨退变的作用。对炎症因子与软骨退变间的影响，往往认为是一方主导另一方的改变。

但实验结果显示，A组膝关节表面光滑未见裂纹、纤维化及软化等，软骨细胞排列有序，无异常群集或增殖；而造模8周后表面凹凸不平，局部可见裂纹及纤维化，软骨细胞异常群集、排列无序；中药干预后，局部逆转软骨的钙化、纤维化等，改善软骨细胞的异化作用。与此同时，B组实验兔关节液中IL-1β、TNF-α水平显著增高，而C组及D组水平明显下降，且与模型组比较差异有统计学意义。兔血清中IL-1β、TNF-α水平也表现出与关节液中相一致的结果，进而说明中药复方具有多靶点、多机制的作用，能够从整体着手调节人体的生理病理。以上研究结果表明，炎症因子的表达量与软骨面的改变存在一定的正向相关性。所以通过本实验发现，软骨面的改变与炎症因子之间存在相互作用。软骨面遭到破坏，导致血管、裂纹及微裂隙数量的增加，进而扰乱软骨与软骨下骨之间的分子交互作用。同时，炎性因子的活跃不断刺激软骨，导致软骨钙化、纤维化等，由此形成一个持续的“恶性循环”。

基于以上研究结果，笔者认为“通络治痹汤”能够抑制炎症反应，延缓软骨退化，促进软骨修复，改善关节生理功能。但本实验仍存在一定的不足，对于其修复软骨面的作用机制尚不清楚。故本课题组将在后续实验中深入研究，并通过体外研究方式，找出“通络治痹汤”的抗OA作用机制。

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