藜麦总皂苷含量测定方法的比较

熊成文，李晓伟，徐得娟

（1.青海省食品检验检测院，青海西宁810016；2.青海高远锦禾生态农牧科技有限公司，青海西宁810016）

研究表明许多藜麦中的皂苷类成分具有多种药理活性[1]，包括镇痛、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗病毒[2]和抗细胞毒性，影响矿物质、维生素的吸收和动物生长，具有溶血和增强免疫的作用，还有增加肠黏膜渗透性，保护神经，以及降低脂肪吸收等作用[3-5]。据报道藜麦皂苷抗真菌时，单体皂苷的活性很小或基本没有活性，而藜麦总皂苷在50μg/mL时可有效抑制白色念珠菌，说明不同皂苷之间具有协同作用[6]。藜麦皂苷具有杀螺活性[7]，还可以作为黏膜疫苗注射的助剂[8]，藜麦皂苷的构效关系的研究结果表明的五环骨架可提高药物的选择性[9]，因此，藜麦皂苷为治疗和化疗药物的开发提供了更为丰富的资源，藜麦皂苷作为药物也有更为广泛的应用前景。

建立一种可靠、准确的藜麦皂苷含量测定方法，可为藜麦皂苷广泛用于药品、化妆品、食品添加剂等行业提供有利的评价手段，同时也可为藜麦的加工工艺水平提供参考。本文尝试通过试验比较两种藜麦皂苷对照品含量方法检测结果的差异，并对不同藜麦加工方法处理后的藜麦中皂苷的残留情况进行了考察，可为以后大规模提取利用藜麦皂苷打下一定的基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

藜麦为青藜一号产自青海省海西蒙古族藏族自治州都兰县，平均海拔3 100m；齐墩果酸对照品（批号110709-200505）：中国食品药品检定研究院；藜麦皂苷A对照品：青海高远锦禾生态农牧科技有限公司制备；香草醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸：均为分析纯；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器设备

Lambda35紫外可见分光光度计：美国PE公司；HH-2数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；101-1S电热鼓风干燥箱：邦西仪器科技（上海）有限公司；FA2004电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JP-030S超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHA-C水浴恒温振荡器：上海华邻实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

藜麦籽实中的皂苷为三萜皂苷[10]，以往在没有藜麦皂苷对照品的情况下通常选用齐墩果酸为对照品[11-12]，但藜麦皂苷的分子量因含有糖苷配基一般在700以上，而齐墩果酸不含糖苷配基分子量为456.71，故分别使用藜麦皂苷A和齐墩果酸作为对照品进行比较。藜麦皂苷A分子结构见图1，分子量810.44。

图1 藜麦皂苷A分子结构Fig.1 M olecular structureof quinoa saponinsA

准确称取齐墩果酸对照品10.1mg，置50mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，制成0.202mg/mL的标准储备溶液。

准确称取藜麦皂苷A对照品6.60mg，置25mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，制成0.264mg/mL的标准储备溶液。

1.3.2 标准曲线

分别精密量取齐墩果酸标准储备溶液各0、50、100、200、400μL和藜麦皂苷A标准储备溶液各0、400、600、800、1 000、1 200 μL 置于干燥的具塞试管中，60℃蒸干，取出放冷，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，摇匀，于60℃水浴中保温15min，取出，用冰水浴冷却10min，加入4mL冰醋酸，摇匀。选取齐墩果酸400μL的标准溶液和藜麦皂苷A 400μL的标准溶液，于400 nm～760 nm范围进行扫描，选定最大吸收波长为测定波长。在最大吸收波长处测定各标准溶液的吸光度A，以吸光度A为纵坐标，以相应对照品浓度（mg/mL）为横坐标，分别绘制标准曲线。

1.3.3 供试品溶液的制备

1.3.3.1 以齐墩果酸为对照品的方法

将一定量的藜麦种子粉碎成藜麦粉，分别称取藜麦粉6份，每份5 g，置于锥形瓶中，按料液比1∶30（g/mL）加入70%乙醇溶液，50℃振荡提取24 h，抽滤得到滤液即为供试品溶液。

吸取供试品溶液400μL，采用与标准溶液相同的方法测定其吸光度值。根据标准曲线求出测定样品中皂苷的质量（m），按照公式求出藜麦中总皂苷的含量。

式中：m为供试液样品中总皂苷质量，mg；V为供试液总体积，mL；M为藜麦总质量，g；v为供试液取样体积，mL。

1.3.3.2 以藜麦皂苷A为对照品的方法

分别称取粉碎好过60目筛的藜麦粉6份，每份1 g，置于100mL锥形瓶中，加入60%乙醇溶液30mL，超声提取30min，4 000 r/min离心5min，取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液回收乙醇至无醇味，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次10mL，合并萃取液，挥干溶剂，残渣用甲醇溶解，转移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液400μL，置于具塞试管中，60℃蒸干，取出放冷，采取与标准溶液相同的方法测定其吸光度A。根据标准曲线查得供试品溶液中总皂苷的浓度（mg/mL），按照公式计算出藜麦中总皂苷的含量。

式中：C为供试品溶液中总皂苷的浓度，mg/mL；V为供试品溶液的总体积，mL；W为藜麦重量，g。

1.3.4 不同测定方法含量测定结果的比较

分别按文献报道方法和本次试验采用的方法称取粉碎好的藜麦粉各6份，测定其藜麦总皂苷的含量，比较两种方法测定的差异。

1.3.5 不同加工工艺去除藜麦皂苷

由于藜麦皂苷是一种抗营养物质[13-14]，并且具有苦涩的味道，因此食用前需尽可能除去[15]。藜麦籽实中的皂苷主要来源于壳中，脱壳会去除大量皂苷，通常采用湿法、干法和混合法去除藜麦籽实中的皂苷。湿法需要使用大量的水洗涤[16]，水质污染问题是其主要的问题。干法是使用机器碾磨籽实去除藜麦皂苷，一般干法更为经济、简单、无污染，但效果较差，仅能去除80%的皂苷[17]，一些营养物质也会流失。混合法先快速碾磨籽实，然后简单冲洗，避免了营养的流失也降低了水中皂苷的含量。通过对湿法和混合法处理后藜麦籽实中皂苷含量的测定，确定最佳的加工工艺。

2 结果与分析

2.1 检测波长的测定

有文献报道[11]，齐墩果酸采用的检测波长为560nm，齐墩果酸标准溶液紫外光谱图见图2。由图2可知，紫外光谱图中齐墩果酸对照品在400 nm～760 nm处的最大吸收波长为545 nm，因此，选用545 nm作为检测波长，藜麦皂苷A标准溶液紫外光谱图见图3。由图3可知，藜麦皂苷A对照品在400 nm～760 nm处的最大吸收波长为482 nm，因此，选用482 nm作为检测波长。

图2 齐墩果酸标准溶液紫外光谱图Fig.2 Ultraviolet spectrum of oleanolic acid

图3 藜麦皂苷A标准溶液紫外光谱图Fig.3 Ultraviolet spectrum of quinoa saponins A

2.2 标准曲线的绘制

通过数据处理得到的齐墩果酸标准溶液回归方程为：A=48.171C，r=0.997 2，在 0.004 04 mg/mL～0.040 4mg/mL范围内线性关系良好。

通过数据处理得到的藜麦皂苷A标准溶液回归方程为：A=11.811C，r=0.995 1，在 0.021 12mg/mL～0.063 36mg/mL范围内线性关系良好。

2.3 不同方法含量测定结果的比较情况

不同方法藜麦皂苷含量测定结果见表1。

表1 不同方法藜麦皂苷含量测定结果Table1 The resultof determ ination of quinoa saponin by diferentmethods

采用t检验，计算得t值为66.653，查t检验临界值表得 t0.05，10=2.228，t＞t0.05，10，说明两种方法测得的含量均值存在显著性差异。

2.4 不同加工工艺去除藜麦皂苷效果

藜麦籽实经不同加工工艺后总皂苷含量测定结果见表2。

表2 藜麦籽实经不同加工工艺后总皂苷含量测定结果Table2 The resultof determ ination of totalsaponin in quinoa after different processing

从表2可以看出，碾磨加工后藜麦籽实中皂苷的量减少了一半，随着水洗次数的增加皂苷的量也不再明显减少，说明皂苷主要集中在籽实的外壳中，通过碾磨能有效的去除皂苷。单纯水洗也能够去除藜麦中的皂苷，随着清洗次数的增加，皂苷的量呈现逐渐降低的趋势，当清洗2次后皂苷的量不再明显降低，清洗2次就可以除去大部分皂苷。对碾磨后分离得到的种皮粉末中的皂苷含量进行检测，平均含量为100.35mg/g，是未加工藜麦籽实中皂苷含量的4倍。

3 结论与讨论

藜麦皂苷味苦，是藜麦中主要的抗营养物质，在藜麦籽实中含量较高[18]不利于作为食物和饲料应用。同时皂苷类物质具有一定的生物活性[19-21]，可用于药品[22]、保健食品、化妆品、生物农药、食品添加剂使用[23-24]，因此建立一种简便、可靠的藜麦皂苷测定方法十分必要。采用超声波提取，香草醛-高氯酸比色法测定藜麦中皂苷含量，以藜麦皂苷A为对照品，检测波长482 nm，样品提取采用60%乙醇溶液，料液比1 ∶30（g/mL），提取时间 30min，连续提取 2 次的方法能够测得藜麦中总皂苷含量。

湿法去除藜麦籽实中的皂苷效果较好，能最大程度的去除皂苷，但水质污染是其存在的主要问题，并不适用于大规模生产的应用。混合法去除藜麦籽实中的皂苷，通过碾磨步骤就能够去除大部分的皂苷，只需通过一次水洗就能够去除籽实表面残留的种皮粉末，适合大规模生产的应用。

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