异烟肼致肝细胞损伤过程中组蛋白乙酰化对内质网应激的调控作用

李金凤，杜莹，李标，张一杨，李莹淑，韩铁生，任琦，冯福民

(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063000)

异烟肼(INH)是WHO推荐的一线抗结核药物，在抗结核治疗中具有不可替代的作用[1，2]，但长期服用可导致药物性肝损伤。流行病学调查表明，长期服用INH的结核患者转氨酶升高发生率为10%～20%[3]，其中1%～3%患者可出现严重肝损伤，已成为抗结核治疗终止的重要原因之一[4]。肝细胞损伤后，打破了细胞内组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的动态平衡，干扰了染色质重塑，造成炎性因子(如IL-6)、氧化应激指标(如活性氧)等基因异常表达[5，6]。当受损的肝细胞持续受到INH刺激时，大量未折叠蛋白在内质网腔内堆积，产生内质网应激(ERS)[7]。有研究表明，组蛋白乙酰化酶P300可特异性结合在葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因启动子区，调控其下游ERS相关基因表达，继而参与细胞周期调控[8]；非酒精性脂肪肝中组蛋白去乙酰化酶HDAC1水平变化可影响CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达，引起慢性ERS，扰乱肝细胞脂质平衡，诱导肝细胞脂肪变性[9，10]。目前在INH致肝细胞损伤过程中组蛋白乙酰化与ERS是否有关尚不清楚。C646为P300的抑制剂，可通过降低P300表达参与细胞的各种生命活动[11]；MS-275可通过抑制HDAC1降低组蛋白乙酰化水平，与基因转录活性有关[12]。因此推测，组蛋白乙酰化可能通过调控ERS参与INH致肝细胞损伤。2017年1～5月，我们在INH致肝细胞损伤模型中分别给予C646或MS-275干预，观察了组蛋白乙酰化对ERS的调控作用，以期为INH致肝细胞损伤的预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常肝细胞株HL-7702(以下称HL-7702细胞)，购自中国科学院上海分院。INH，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；C646，美国Cayman Chemical公司；MS-275，瑞士J&K Scientific Ltd公司。台式高速冷冻离心机，德国Heraeus集团；PCR基因扩增仪，美国Bio-Rad公司；酶标仪，美国Molecular Devices公司；荧光定量RCR仪，美国Applied Biosystems公司。二甲基亚砜，日本东京化成工业株式会社；RPMI 1640，美国Corning cellgro公司；ALT、AST检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；TaKaRa反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；TRIzol，北京百泰克生物技术有限公司；ELISA试剂盒，中国北京冬歌伟业科技有限公司。

1.2 细胞培养 将HL-7702细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640培养液中，制成细胞悬液。取细胞悬液5～7 mL分装于50 mL细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，隔天换液1次，待培养瓶底铺满单层细胞时，按1∶2比例进行传代。取传5代对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 肝细胞损伤模型制备及鉴定 参照本课题组前期研究方法制备肝细胞损伤模型[13]。取传5代对数生长期细胞，接种于含RPMI 1640培养液的6孔板，每孔2×105个，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中常规培养。培养24 h，随机将细胞分为观察组、对照组，观察组更换为含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培养液，对照组更换为新的RPMI 1640培养液，继续培养3 h，收集细胞培养液，1 000×g离心5 min，留取上清液。采用ELISA法检测培养液上清ALT、AST活性。根据ALT、AST检测试剂盒说明绘制标准曲线，并按标准曲线计算ALT、AST活性。结果显示，观察组培养液上清ALT活性为(4.31±0.40)IU/L，AST活性为(5.87±0.54)IU/L，对照组分别为(1.44±0.32)、(4.73±0.59)IU/L。观察组培养液上清ALT、AST活性均明显高于对照组(P均<0.05)。表明观察组已经出现肝细胞损伤。

1.4 细胞分组处理 取传5代对数生长期细胞，接种于含2 mL RPMI 1640培养液的6孔板，每孔2×105个，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中常规培养。培养24 h，随机将细胞分为空白对照组、INH组、C646组、INH+C646组、MS-275组和INH+MS-275组，每组设6个复孔。空白对照组更换为2 mL新的RPMI 1640培养液；INH组更换为2 mL含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培养液；C646组更换为2 mL含C646 5 μmol/L的RPMI 1640培养液；INH+C646组更换为2 mL含C646 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培养液；MS-275组更换为2 mL含MS-275 5 μmol/L的RPMI 1640培养液；INH+MS-275组更换为含MS-275 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培养液。各组继续培养3 h。

1.5 相关指标观察

1.5.1 肝细胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表达 采用Real-time PCR法。收集各组处理3 h细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，酶标仪检测260、280 nm波长处的吸光度(A)值，A260/A280为1.8～2.0，表明提取的总RNA纯度合格。取总RNA 2 μL，按照TaKaRa反转录试剂盒说明将其反转录为cDNA，反应条件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 1 min。以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。P300上游引物：5′-AGAAGATGAAGCGGGTTGTG-3′，下游引物：5′-CAGTTGGTGTCGTTGGAGTG-3′；HDAC1上游引物：5′-GGCATCTGGCTTCTGTTACG-3′，下游引物：5′-CTCGTCATCAATCCCGTCTC-3′；GRP78上游引物：5′-GCACAGACGGGTCATTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTATGTCGCCTTCACTCC-3′；CHOP上游引物：5′-CAGAACCAGCAGAGGTCACA-3′，下游引物：5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，下游引物：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。PCR反应体系共20 μL：ROX Reference Dye 0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，DEPC水6.8 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL；反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复6次，取平均值。

1.5.2 肝细胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量 采用ELISA法。收集各组处理3 h细胞培养液，1 000×g离心5 min，留取培养液上清。根据ELISA试剂盒说明绘制标准曲线，根据标准曲线计算各组P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量。

2 结果

2.1 各组P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表达比较 见表1。

2.2 各组培养液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比较 见表2。

表1 各组P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA相对表达量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与INH组比较，#P<0.05。

表2 各组培养液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与INH组比较，#P<0.05。

3 讨论

结核病是由结核杆菌引起的、严重威胁人类健康的慢性疾病。据WHO报道，近年来结核病“死灰复燃”，与艾滋病、疟疾一起成为三大传染病。我国是结核病高负担国家之一，WHO推荐的一线抗结核药物INH、利福平、吡嗪酰胺等均对肝脏有不同程度毒性作用，联合用药时肝损害更严重，严重时可发生慢性肝炎、肝纤维化甚至肝衰竭等，常常迫使抗结核治疗中断，继而患者病情加重，同时亦使结核杆菌耐药风险增加。抗结核药物性肝损伤由抗结核药物代谢终产物在体内蓄积引起，破坏了细胞内稳态，导致肝细胞凋亡，继而产生肝损伤，其严重程度因个体差异而不同，目前尚难预测。因此，探讨抗结核药物性肝损伤中的发生机制具有重要意义。

INH在体内主要经肝脏代谢，在肝细胞中经过乙酰转移酶2和细胞色素P450酶系催化，大部分代谢产物经肾脏排出体外，但小部分代谢产物可在体内残留、蓄积，并可直接与肝细胞内大分子结构发生共价结合，改变细胞内组蛋白乙酰化水平，进而诱发肝细胞损伤。组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰化酶P300和组蛋白去乙酰化酶HDAC1共同调控，可通过调控IL-2等转录因子活性，增强细胞内NF-κB等炎性因子表达，继而参与酒精性脂肪肝、肝纤维化等肝脏疾病的发生、发展[14]。P300可结合到组蛋白N端富含赖氨酸残基的尾部，促进染色质转录激活，启动组蛋白乙酰化作用，而HDAC1可使染色质结构致密，抑制基因转录，使组蛋白去乙酰化，二者可相互拮抗。有研究报道，INH能通过影响P300和HDAC1的动态平衡来改变细胞中组蛋白乙酰化状态，从而导致大鼠肝细胞损伤[15]。本研究通过INH处理HL-7702细胞制备肝细胞损伤模型，结果显示，观察组培养液上清ALT、AST含量明显高于对照组，证实INH处理可致肝细胞损伤。本研究结果显示，与空白对照组比较，INH组P300 mRNA表达和蛋白含量均明显降低，HDAC1 mRNA表达和蛋白含量均明显增加，证实组蛋白乙酰化参与INH致肝细胞损伤过程，与本课题组前期研究[15]结果一致。

内质网是真核生物细胞中与分泌相关的重要细胞器，可参与蛋白的合成、转运、折叠和修饰。当外源性或内源性物质刺激细胞时，大量未折叠和错误折叠的蛋白在内质网堆积，影响细胞内钙稳态，诱发ERS。GRP78表达增加会促进细胞存活，而促凋亡分子CHOP表达增加则会促进细胞凋亡，二者作为ERS的标志性分子，在ERS过程中具有重要作用。既往研究发现，ERS与非酒精性脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病的发生、发展密切相关[16～19]。槲皮素可升高CHOP mRNA和蛋白表达，激活ERS信号通路，诱导肝星状细胞凋亡[20]；糖尿病大鼠经链唑霉素处理后，肝组织GRP78蛋白表达明显升高，未折叠蛋白反应作为ERS的保护性反应，其信号通路被激活，导致肝细胞损伤[21]。本研究结果显示，与空白对照组比较，INH组GRP78、CHOP mRNA表达和蛋白含量均明显升高，说明ERS参与INH致肝细胞损伤过程。但组蛋白乙酰化是否参与调控ERS，继而导致肝细胞损伤尚不清楚。

研究报道，在大鼠心肌缺血再灌注损伤中，曲古霉素A可上调ERS相关蛋白GRP78启动子处组蛋白H4乙酰化水平[22]；丙戊酸可通过抑制HDAC活性提高GRP78蛋白表达和整体组蛋白H3的乙酰化水平，抑制CHOP上调，促进内质网分子伴侣表达，减轻ERS诱导的糖尿病肾病细胞凋亡[23]。组蛋白乙酰化可促进CFTR基因表达，诱发ERS，促进高同型半胱氨酸所致损伤肝细胞的凋亡[24]。上述研究表明，组蛋白乙酰化可在一定程度上调控ERS，但其调控ERS参与肝脏疾病的报道鲜见。组蛋白乙酰化酶抑制剂C646对P300具有高度选择性，可通过结合到P300的Lys-CoA结构区对其功能产生竞争性抑制；而组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275能显著抑制HDAC1活性，增加细胞内组蛋白乙酰化程度。为进一步研究INH致肝细胞损伤中组蛋白乙酰化对ERS的调控作用，我们在制备肝细胞损伤模型同时分别加入C646或MS-275干预，结果显示，与INH组比较，INH+C646组中P300 mRNA表达和蛋白含量均明显降低，说明其组蛋白乙酰化水平降低，而ERS标志性分子GRP78 mRNA表达和蛋白含量均明显下降，CHOP mRNA表达和蛋白含量均明显升高，说明肝细胞损伤加重；与INH组比较，INH+MS-275组HDAC1 mRNA表达和蛋白含量均明显降低，说明组蛋白乙酰化水平升高，GRP78 mRNA表达和蛋白含量均明显升高，CHOP mRNA表达和蛋白含量均明显降低，说明ERS得到缓解，肝细胞损伤减轻。由此可见，在INH致肝细胞损伤过程中，C646和MS-275均可通过改变细胞内组蛋白乙酰化状态参与调控ERS，进而影响肝细胞损伤的发生、发展。

综上所述，组蛋白乙酰化通过调控ERS参与INH致肝细胞损伤。但组蛋白乙酰化参与ERS的具体作用机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。

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