氢气对慢性间歇性低氧大鼠肝脏氧化应激损伤的改善作用*

杨胜昌，陈玲玲，傅 天，李文雅，吉恩生△

（1.河北中医学院，石家庄050200；2.河北医科大学，石家庄050017）

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）以间歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）为典型的病理生理特征，其缺氧／复氧的过程类似于缺血／再灌注损伤，可通过氧化应激引起多器官损伤，也是引起代谢综合征和胰岛素抵抗的独立危险因素［1］。研究显示，伴随OSAS的非酒精性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者，CIH可促进其病程发展，从非酒精性脂肪肝进展为肝脂肪变性、肝硬化甚至肝癌。未伴随NAFLD大鼠，CIH也可独立驱动肝脂质过氧化过程，促进炎症反应调控因子活性，进而造成轻度肝损伤［2］。目前OSAS常用的治疗方法包括持续正压通气治疗、口腔矫治器治疗及手术治疗，但这些方法副作用大或患者依从性差。氢气为一种小分子还原性气体，具有抗氧化作用，吸入氢气或者静脉注射含有氢气的生理盐水具有减轻氧化应激及炎症反应的作用，从而对缺血／再灌注损伤脏器有明显的改善作用［3］。本研究通过建立慢性间歇性低氧模型，模拟临床睡眠呼吸暂停的周期性低氧状态，探究吸入氢气对间歇性低氧引起肝脏损伤中炎症因子及氧化应激指标的影响，为OSAS治疗寻求新的方法途径提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠，体重180～200 g，由河北医科大学实验动物中心提供，大鼠被饲养在标准的鼠笼中，每天接受 12 h的光照，自由进水进食。24只雄性 SD大鼠随机分为3组（n＝8）：常氧组（normoxia，Norm组）、间歇性低氧组（CIH组）、氢气（hydrogen，H2）+间歇性低氧组（H2+CIH组）。CIH组大鼠放置于间歇性低氧装置内，前 1.5 min向舱内充入氮气使氧浓度降低到9%，后1.5 min向舱内充入氧气，使氧气浓度逐渐上升至21%。间歇性低氧暴露时间为每个循环 3 min，每天暴露 8 h，共 35 d；H2+CIH组大鼠在每天8 h间歇性低氧暴露前接受1 h浓度为67%H2吸入处理，共35 d；常氧组大鼠置于舱内，充入空气。

1.2 主要试剂与仪器

8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所）；白介素-1（interleukin-1，IL-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（北京北方生物技术研究所有限公司）；谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST）；高 密 度 脂 蛋 白 （high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）（长春汇力生物技术有限公司）；甘油三酯（triacylglyceride，TG）、血清总胆固醇 （serum total cholesterol，TC）（中生北控生物科技股份有限公司）；动物间歇性低氧装置（Oxycycler Model A84BioSpherix）；惠美氢氧雾化机及动物吸氢装置（上海惠美医疗科技有限公司，AMS-H-01型）；H-7650透射电镜（日本日立公司）；半自动生化分析仪（德国豪迈 Humalyzer2000）。

1.3 实验方法

1.3.1 肝脏超微结构的观察 实验结束后，大鼠麻醉状态下开腹，暴露肝脏，取部分肝脏组织置于2.5%戊二醛，1%四氧化锇固定，各级无水乙醇脱水，环氧丙烷过渡，包埋，肝组织超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色。透射电镜下观察肝细胞超微结构的变化。

1.3.2 血清指标的检测 实验结束后，麻醉大鼠，经下腔静脉插管取血，离心提取血清，血清中的8-OHdG采用酶联免疫吸附法测定，IL-1、IL-6采用放免法检测测定，SOD、TC、TG、LDL、HDL、ALT和 AST水平采用化学法测定，具体操作按照试剂盒详细说明进行。

1.4 统计学分析

所有数据录入SPSS 17.0统计学软件，数据用均数±标准差（±s）表示，各组均值的比较行单因素方差分析，用最小显著差异法（LSD）作两两比较。

2 结果

2.1 氢气致慢性间歇性低氧大鼠肝脏功能损伤的改变

电镜下观察到：Norm组肝脏组织细胞形态正常，细胞核形态规则，线粒体嵴整齐排列，内质网正常；CIH组肝脏组织细胞呈现明显空泡化，线粒体嵴融合，部分线粒体及粗面内质网消失，呈现空泡化；H2+CIH组肝脏组织细胞内空泡明显减少，线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张（图1）。

肝脏生化血清学指标显示间歇性低氧组ALT，AST水平显著高于常氧组（P＜0.05）；氢气干预后血清中ALT，AST水平明显降低，与CIH组相比具有统计学意义（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Serum level of ALT，AST（U／L，±s，n＝8）

Tab.1 Serum level of ALT，AST（U／L，±s，n＝8）

CIH：Chronic intermittent hypoxia；ALT：Glutamic-pyruvic transaminase；AST：Glutamic-oxalacetic transaminase*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

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2.2 氢气对慢性间歇性低氧大鼠肝脏脂代谢的作用

间歇性低氧组的TC、TG、LDL水平高于常氧组，差异无统计学意义。氢气干预后的TC、TG、LDL水平较间歇性低氧组降低，差异无统计学意义。各组HDL水平均无统计学差异（表2）。

Fig.1 Effect of hydrogen on liver injury in CIH rats

间歇性低氧组大鼠的血清IL-6水平显著高于常氧组（P＜0.05），氢气干预后的血清IL-6水平明显低于间歇性低氧组（P＜0.05）；而血清 IL-1水平在各组之间的差异无统计学意义（表3）。

Tab.2 Serum level of TC，TG，LDL，HDL（mmol／L，±s，n＝8）

Tab.2 Serum level of TC，TG，LDL，HDL（mmol／L，±s，n＝8）

TC：Serum total cholesterol；TG：Triacylglyceride；LDL：Low density lipoprotein；HDL：High density lipoprotein

Group TC TG LDL HDL Norm 1.28±0.22 0.35±0.21 0.98±0.55 0.24±0.21 CIH 1.44±0.31 0.45±0.23 1.07±0.20 0.25±0.43 CIH+H21.42±0.27 0.38±0.10 1.08±0.13 0.26±0.13

Tab.3 Serum level of IL-1，IL-6（pg／ml，±s，n＝8）

Tab.3 Serum level of IL-1，IL-6（pg／ml，±s，n＝8）

IL：Interleukin*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

Group IL-1 IL-6 Norm 89.62±25.58 63.15±6.88 CIH 127.56±23.47 138.12±19.43*H2+CIH 105.23±10.92 89.20±9.05#

2.3 氢气对慢性间歇性低氧大鼠氧化应激的影响

间歇性低氧处理后，8-OHdG水平明显升高，SOD明显低于常氧组；氢气干预后，8-OhdG水平显著下降，SOD明显升高，与间歇性低氧组相比具有统计学意义（P＜0.05，表 4）。

Tab.4 Serum level of 8-OHdGand SOD（±s，n＝8）

Tab.4 Serum level of 8-OHdGand SOD（±s，n＝8）

8-OHdG：8-hydroxy-2 deoxygua-nosine；SOD：Superoxide dismutase*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

Group 8-OHdG（ng／ml） SOD（U／ml ）Norm 11.71±0.40 193.05±10.07 CIH 12.38±0.62* 225.52±16.04*H2+CIH 11.90±0.31# 280.26±28.51#

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）以间歇性低氧（CIH）为典型病理生理特征，是一种潜在的危险性疾病，OSAS可作为独立的危险因素影响糖尿病，代谢综合征和心血管疾病。流行病调查显示超过4%普通人群及35%～45%的肥胖个体患有OSAS［1，2］。慢性间歇性低氧（CIH）即重复性的缺氧 ／复氧类似于缺血／再灌注损伤可引起多器官损伤，在CIH过程中，反复发作的低氧可升高氧化应激生物标志物水平，氧化应激与炎症之间存在复杂关系，其以不同方式促进炎症反应发生，而随后的炎症状态和再灌注损伤因子又可导致氧化应激生物标志物进一步增加。此过程中还常引发内皮功能障碍、代谢紊乱和胰岛素抵抗［3，4］。OSAS对肝脏的损伤主要表现为肝脏可出现损伤、炎症、纤维化等病理改变。

氢气是一种具有生理活性的还原气体，具有选择性抗氧化作用，在非高压状态下可改善大鼠的脑缺血再灌注损伤，也可降低心肌缺血／再灌注损伤，其易透过细胞膜，即使高浓度氢气也已通过在人类的安全性证明，不具有细胞毒性作用［5］。

本研究结果显示，慢性间歇性低氧模型大鼠肝脏组织超微结构受损严重，肝脏转氨酶升高。另外，以往研究提示间歇性缺氧可诱导脂代谢紊乱而导致脂肪肝的发生，而且脂代谢异常与低氧严重程度密切相关［6，7］。本研究结果发现间歇性低氧模型对成年健康大鼠血脂代谢并无显著影响，大鼠血中TC、TG、LDL仅轻度升高并无统计学意义。结果提示我们所采用模型的低氧程度不足以导致大鼠血脂代谢明显异常。高浓度氢气干预可明显减轻肝脏的损伤和转氨酶升高，提示氢气可以改善间歇性低氧所致肝脏功能的损害，其可能的机制涉及氧化应激和炎症损伤。

8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）作为 DNA氧化损伤指标可反映机体氧化应激水平。OSAS患者尿中8-OHdG水平与OSAS严重程度之间存在相关性，8-OHdG与OSAS患者睡眠呼吸监测指标如睡眠呼吸暂停低通气指数、血氧饱和度下降指数、血氧饱和度小于90%时间、呼吸觉醒指数之间均存在水平相关［8-10］。SOD可催化分解超氧化物自由基减轻其对细胞失衡后的SOD水平降低［11］，而氢气可以降低血清8-OHdG含量，维持SOD水平。氢气作为一种具有生物活性的分子易透过细胞膜介导信号通路可减轻间歇性低氧大鼠肝组织超微结构的损伤，提示氢气可以清除体内的氧自由基，维持正常线粒体活性，从而起到肝脏保护作用。

OSAS患者血清中IL-6水平及IL-6 mRNA的表达与夜间低氧的水平呈正相关［12］。促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α还参与下丘脑、海马等睡眠相关脑区功能调节［13］。本研究显示，间歇性低氧能导致血IL-6水平均显著升高，但是血脂水平并无明显变化，提示CIH启动促炎性反应的信号传导通路与代谢性炎症无关。氢气治疗组IL-6水平降低，提示氢气可能由于减轻氧化应激而间接引起炎症减轻。本实验中该研究未能证实氢气是否直接具有直接抗炎作用而减轻OSAS的炎症损伤。

综上所述，本研究显示间歇性低氧可导致全身氧化应激和炎症反应，进而诱导肝脏功能受损。氢气干预可以明显改善间歇性低氧环境对大鼠肝脏造成的损伤，主要通过减轻氧化应激损伤发挥改善肝细胞损伤的作用。关于氢气治疗间歇性低氧的具体机制还需进一步研究。

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