甘肃产不同生态型板蓝根对小鼠抗炎、免疫调节作用的比较*

赵泽军，王志旺，郭 玫，杜，师 霞，邵 晶，文喜艳

（甘肃中医药大学，兰州730000）

板蓝根为菘蓝（Isatis tinctorria L.）或马蓝（Baphicacanthus cusia）的干燥根，在《神农本草经》中记载并使用超过2千年，是传统的清热解毒中药之一，其性寒、气微、味微甜后苦涩，归心、胃经，具有清热解毒、消肿利咽之功效，主要产于黄河流域。由于我国地域辽阔，不同生态型的板蓝根其品质有一定的差异并可能影响其药效；另一方面，随着四倍体板蓝根（染色体数目加倍）的栽培，四倍体板蓝根的功效有待于进一步考察。鉴于此，将采自不同产地板蓝根和四倍体板蓝根的种子栽培于甘肃省和政县，从抗炎、免疫调节等方面来探讨生态型与四倍染色体对板蓝根药理作用的影响，为我省板蓝根优良品种的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

板蓝根，将河北石家庄市、甘肃陇西县、山西左权县等地购买的板蓝根种子（包括河北石家庄市四倍体板蓝根种子）种植于甘肃中医药大学和政药用植物园，经杜教授鉴定为十字花科植物菘蓝lsatis indigotica Fort的干燥根。吲哚美辛片，广东华南药业集团有限公司产品，批准文号：国药准字H44020701，产品批号：20150912。注射用环磷酰胺，Baxter Oncology GmbH（德国），批准文号：H20110407，产品批号：5H072A。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，生产批号：20160502、20160504；白 三 烯 B4（leukotriene B4，LTB4）、考马斯亮蓝蛋白试剂盒，上海瑞齐生物科技有限公司产品，生产批号：20160602、201600601；白介素-4（interleukin-4，IL-4）、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、α-肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）测试盒，深圳达科为生物技术有限公司产品，产品批号 E6050-1202-3、E6040-1206-1、E6060-1209-1。其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

电子天平（BS1103 sartorius），北京赛多里斯有限公司；恒温水浴锅（HH-S），金坛市正基仪器有限公司生产；高速冷冻离心机（TGL-16G），上海安亭科学仪器厂生产。

1.3 动物

SPF级KM小鼠209只，雌雄兼用，体重（20±2）g，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，动物许可证：SCXK（甘）2015-0002；甘肃中医药大学科研实验动物中心饲养，实施许可证：SYXK（甘）2015-0005。

1.4 甘肃产不同品系板蓝根对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响［1］

将小鼠随机分成6组，即空白对照组、吲哚美辛组（8 mg／kg）、石家庄二倍体板蓝根组（Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，SJZ-2）（5 g／kg）、石家庄四倍体板蓝根组（Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，SJZ-4）（5 g／kg）、陇西二倍体板蓝根组（Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，LX-2）（5 g／kg）、左权二倍体板蓝根组（Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu，ZQ-2）（5 g／kg）。按上述剂量灌胃给药20 ml／kg，每日 1次，连续4 d。最后一次给药1 h后，各小鼠右耳两侧涂抹50μl二甲苯，致炎30 min后处死动物，剪下双耳，用内径9 mm打孔器在双耳相同部位取耳片，精密称重，以左右耳片重量差值表示肿胀度，并以下式计算肿胀抑制率：肿胀抑制率（%）＝

1.5 甘肃产不同品系板蓝根对甲醛所致小鼠足肿胀的影响［2］

小鼠分组、给药同1.4。末次给药后，于各小鼠右后足足垫皮下注射5%甲醛50μl，致炎4 h后处死动物，在小鼠后足同一部位处剪下左右后足，精密称重，以左右后足重量差值表示肿胀度，并计算肿胀抑制率。

1.6 甘肃产不同品系板蓝根对甲醛致小鼠气囊滑膜炎的影响［3-5］

将小鼠随机分成7组：即空白对照组、模型对照组、吲哚美辛组（8 mg／kg）、石家庄二倍体板蓝根组（SJZ-2）（5 g／kg）、石家庄四倍体板蓝根组（SJZ-4）（5 g／kg）、陇西二倍体板蓝根组（LX-2）（5 g／kg）、左权二倍体板蓝根组（ZQ-2）（5 g／kg）。按上述剂量灌胃给药20 ml／kg，每日1次，连续7 d。在第1次给药后于小鼠背部皮下注入空气5 ml，第3天及第5天再次注入空气以维持气囊的大小，第6天向小鼠背部气囊内注入1%甲醛0.2 ml，致炎8 h后麻醉、取血，分取血清测定SOD与MDA的含量；处死动物，向气囊内注入生理盐水进行灌洗、测定灌洗液中总蛋白及LTB4的含量。

1.7 甘肃产不同品系板蓝根对环磷酰胺模型小鼠的免疫调节作用［6，7］

将小鼠随机分成6组：即空白对照组、模型对照组、石家庄二倍体板蓝根组（SJZ-2）（5 g／kg）、石家庄四倍体板蓝根组（SJZ-4）（5 g／kg）、陇西二倍体板蓝根组（LX-2）（5 g／kg）、左权二倍体板蓝根组（ZQ-2）（5 g／kg）。按上述剂量灌胃给药20 ml／kg，每日1次，连续7 d。从第4天开始，给药1 h后，小鼠皮下注射环磷酰胺20 mg／kg，连续注射4 d；空白对照组皮下注射生理盐水。末次给药1 h后麻醉动物，取血经抗凝后用血细胞分析仪作血常规检测，其余血液分取血清，测定其中 IFN-γ、IL-4与 TNF-α的水平。小鼠颈椎脱臼处死，摘取胸腺、脾脏，称量，计算脏器指数。

1.8 数据处理

实验结果采用均数±标准差（±s）的形式表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），应用SPSS11.5统计软件进行统计分析和描述。

2 结果

2.1 甘肃产不同生态型板蓝根对小鼠耳、足肿胀的影响

小鼠耳廓涂抹二甲苯后肿胀明显，经板蓝根干预后，耳廓肿胀度明显下降，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对耳廓肿胀度的影响未出现明显差异；小鼠足趾部注射甲醛后肿胀明显，经板蓝根干预后足廓肿胀度明显缓解，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对耳廓肿胀度的影响没有明显差异（表1）。

Tab.1 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on auricle swelling test and foot swelling test（±s，n＝11）

Tab.1 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on auricle swelling test and foot swelling test（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxidiploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

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2.2 甘肃产不同生态型板蓝根对小鼠气囊滑膜炎渗出物中总蛋白、LTB4及小鼠血清SOD、MDA的影响

小鼠气囊滑膜炎渗出物中总蛋白与LTB4明显升高，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。经板蓝根干预后总蛋白与LTB4明显下降，与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对小鼠气囊滑膜炎渗出物中总蛋白及LTB4的影响没有明显差异；气囊滑膜炎小鼠血清SOD明显下降，MDA显著上升，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。经板蓝根干预后上述变化得到明显改善，与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.01），甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对气囊滑膜炎小鼠血清SOD、MDA的影响没有明显差异（表2）。

2.3 甘肃产不同生态型板蓝根对环磷酰胺模型小鼠脏器指数的影响

给小鼠注射环磷酰胺后胸腺指数、脾脏指数明显下降，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。在板蓝根的干预下，上述变化得到了不同程度的缓解，其中胸腺指数与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对环磷酰胺模型小鼠脏器指数的影响未出现明显差异（表3）。

Tab.2 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on total protein and LTB4 in inflammatory exudates and SOD and MDA in serum（±s，n＝11）

Tab.2 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on total protein and LTB4 in inflammatory exudates and SOD and MDA in serum（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LTB4：Leukotriene B4；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malonaldehyde*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group Total protein（mg／ml）LTB4（ng／ml）SOD（U／ml）MDA（nmol／ml ）Control 3.54±0.84** 21.33±3.71** 11.19±1.87** 6.16±1.57*Model 8.19±2.01 39.24±7.51 8.59±1.17 12.39±2.35 Indometacin 4.41±1.24** 29.25±6.22** 10.12±1.43* 9.22±2.22**SJZ-2 5.81±1.91** 27.32±5.82** 10.46±1.40** 9.08±2.15**SJZ-4 5.30±1.87** 26.50±5.56** 10.68±1.64** 8.39±2.07**LX-2 5.95±1.94* 29.20±6.53** 11.12±1.68** 7.31±1.90**ZQ-2 6.09±1.98* 31.07±6.70* 10.53±1.46** 8.92±2.15**

2.4 甘肃产不同生态型板蓝根对环磷酰胺模型小鼠红细胞、白细胞计数的影响

给小鼠注射环磷酰胺后血液红细胞与白细胞计数显著下降，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。在板蓝根的干预下，上述血象异常变化得到明显的缓解，红细胞计数、白细胞计数与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对环磷酰胺模型小鼠血象的影响没有明显差异（表4）。

2.5 甘肃产不同品生态型蓝根对环磷酰胺模型小鼠细胞因子的影响

环磷酰胺模型小鼠血清IFN-γ、IL-4明显下降，而TNF-α明显升高，与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。经板蓝根干预后，上述异常变化得到明显的改善，与模型对照组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；甘肃产不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根对环磷酰胺模型小鼠血清IFN-γ、IL-4、TNF-α的影响没有明显差异（表5）。

Tab.3 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on thymus and spleen index in mice（mg／g，±s，n＝11）

Tab.3 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on thymus and spleen index in mice（mg／g，±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

3.16±0.57 Group Thymus index Spleen index Control 2.42±0.38 4.04±0.71 Model 1.70±0.19** 2.99±0.48**SJZ-2 2.11±0.39## 3.10±0.65 SJZ-4 2.17±0.43## 3.34±0.74 LX-2 2.24±0.50## 3.38±0.56 ZQ-2 2.06±0.41#

Tab.4 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on red and white cells count in mice（±s，n＝11）

Tab.4 Effects of Isatidis Radix from different ecotype on red and white cells count in mice（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu**P＜0.05 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Red cells count（1012／L）White cells count（109／L）Control 8.38±0.79 5.15±0.58 Model 5.64±0.63** 3.26±0.38**SJZ-2 6.43±0.70# 3.86±0.43##SJZ-4 6.50±0.69## 3.94±0.42##LX-2 6.63±0.71## 4.04±0.49##ZQ-2 6.38±0.68# 3.74±0.41##

Tab.5 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on cytokines in mice（±s，n＝11）

Tab.5 Effects of Isatidis Radixfrom different ecotype on cytokines in mice（±s，n＝11）

SJZ-2：Shijiazhuang diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；SJZ-4：Shijiazhuang tetraploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；LX-2：Longxi diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；ZQ-2：Zuoquan diploid Isatidis Radixcultivated in Gansu；IFN-γ：Interferon-γ；IL-4：Interleukm-4；TNF-α：Tumor necrosis factor-α**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group IFN-γ（pg／ml）IL-4（pg／ml）TNF-α（pg／ml ）Control 96.67±20.47 121.89±24.15 277.06±29.10 Model 44.62±8.44**76.16±16.16**466.16±42.97**SJZ-2 73.88±16.13##92.89±14.95#372.94±31.14##SJZ-4 79.18±17.98##99.12±19.52##360.62±33.46##LX-2 82.09±18.58##104.30±20.14##357.28±33.81##ZQ-2 71.72±14.98##94.78±18.03#380.66±34.53##

3 讨论

生态型（ecotype）是指同一物种因生长环境不同而导致在结构或功能等方面出现差异的不同类群，是遗传变异与自然选择的结果，代表了不同的基因型。一般来说，将不同生态型的物种移植于同一生境，仍保持其稳定的差异［8］。我国地域辽阔，不同产地间中药材的人工引种越来越普遍；甘肃地处西北，适宜中药材人工种植，特别是板蓝根的种植使民乐县被誉为“中国板蓝根之乡”［9］。另一方面，四倍体板蓝根适应性较强，对环境要求不高，而且产量高。随着乔传卓等［10］对板蓝根四倍体育种成功并推广种植，四倍体板蓝根与二倍体板蓝根之间的差异、特别是药理作用等方面的差异亦受到人们的关注，再者板蓝根药材目前品种退化问题较为严重。基于以上原因，本研究组从甘肃陇西县、山西左权县、河北石家庄市等地采购板蓝根种子（包括河北石家庄市四倍体板蓝根）并种植于甘肃中医药大学和政药用植物园（甘肃省和政县境内），在考察不同生态型板蓝根及四倍体板蓝根的生物学特性、有效组分含量等方面差异的基础上，基于清热解毒的中药功效对其抗炎、调节免疫等作用进行实验研究，为我省板蓝根优良品种选育提供依据。

耳肿胀法与足肿胀法是抗炎实验的经典方法，甘肃产不同生态型的板蓝根及四倍体板蓝根对小鼠耳肿胀度、足肿胀度有明显的抑制作用。本研究发现，甘肃产不同生态型的板蓝根及四倍体板蓝根能明显缓解胸腺与脾脏指数的下降趋势、提高红细胞计数和白细胞计数、抑制血清IFN-γ、IL-4的下降。临床与实验证实，机体在贫血状态时免疫功能也会下降，而紊乱的免疫系统会引起造血负向调控因子如TNF-α的异常升高；不同生态型的板蓝根及四倍体板蓝根能明显降低TNF-α的水平，这与之前的研究相一致［11］。在上述研究过程中，甘肃产不同生态型的板蓝根及四倍体板蓝根之间的抗炎与免疫调节作用均未出现明显差异，提示不同生态型的板蓝根及四倍体板蓝根在抗炎与免疫调节等药理作用方面可以替代使用，为四倍体板蓝根的应用提供依据。

【参考文献】

［1］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.第3版，北京：人民卫生出版，2002：886.

［2］ 宋晓莉，王吉吉明，吴再旺，等.奇任醇对不同大鼠关节炎症模型作用的对比［J］.中国新药杂志，2011，20（3）：257-261.

［3］ 王志旺，郭 玫，马 丹，等.甘南栽培唐古特大黄抗炎作用及机制分析［J］.中国实验方剂学杂志，2016，22（1）：158-161.

［4］ 高 阳，王志斌，左泽平，等.大鼠背部气囊滑膜炎模型的探讨［J］.中药药理与临床，2013，29（2）：189-192.

［5］ 刘晓霞，王志旺，陈小平，等.荣骨定痛膏的镇痛抗炎作用及其机制［J］.中国应用生理学杂志，2015，31（5）：462-464.

［6］ 丁喜炎，季 琳，程 雪，等.不同硫熏替代技术的黄芪药材对小鼠免疫功能影响研究［J］.中国中药杂志，2016，41（15）：2817-2821.

［7］ 齐丽娟，宋 雁，王 伟，等.用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型［J］.卫生研究，2010，39（3）：313-315.

［8］ 黄林芳，索风梅，宋经元，等.中国产西洋参品质变异及生态型划分［J］.药学学报，2013，48（4）：580-589.

［9］ 王朝霞，张德毓.民乐荣获“中国板蓝根之乡”称号［N］.每日甘肃网-甘肃日报，2012-08-01.

［10］乔传卓，吴美枢，戴富宝，等.菘蓝多倍体育种的研究［J］.植物学报，1989，31（9）：678-683.

［11］朱映黎，张建军，王景霞，等.芍药内酯苷和芍药苷对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及对GM-CSF，IL-3，TNF-α影响的比较研究［J］.中国中药杂志，2015，40（2）：330-333.