不同浓度表儿茶素没食子酸酯对体外培养成骨细胞的影响

谢睿锋 李 岩 王 东

1.山西医科大学，山西太原 030000；2.山西医科大学第二医院骨科，山西太原 030000

随着人类寿命的逐渐延长，我国开始进入老龄化国家。骨质疏松症越来越突出地影响老年人的生活质量。随着学者对于氧化应激在骨质疏松发病机制中的进一步研究，应用抗氧化剂茶多酚预防和治疗骨质疏松逐步成为国内外研究的新热点之一。有证据显示茶多酚具有抗氧化的作用，可通过抑制氧化应激反应而减少骨量流失，从而起到预防治疗骨质疏松的作用[1，2]。茶多酚中含有75%～80%的儿茶素，有研究已证实在儿茶素成分中表儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechgin gallate，EGCG）是其中含量最多并且药用活性最强的成分[3]。本研究通过分离和培养新生SD大鼠颅骨诱导的成骨细胞，研究在体外环境下EGCG对新生SD大鼠成骨细胞的作用，寻找EGCG的作用浓度，即促进浓度或抑制浓度，为EGCG应用于临床预防及治疗骨质疏松提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

出生3 d内的SD大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供。EGCG、Ⅱ型胶原酶、胰酶（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM 培养基（Hyclone，USA）；胎牛血清（四季青生物工程材料有限公司）；成骨诱导分化培养基试剂盒 （赛业生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（同仁化学研究所）；VEGF ELISA试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取新生3 d以内的健康SD大鼠，处死后在无菌条件下切下颅骨，剥除骨膜等软组织，将颅骨充分剪碎，PBS冲洗，加入1%的胰蛋白酶消化10 min后加DMEM培养基终止消化，弃去消化液；加入0.2%胶原酶Ⅱ处理30 min，弃去消化液；加入0.2%胶原酶Ⅱ处理60 min，将消化液移入15 mL离心管中，室温条件下1500 r/min离心5 min；弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 3.5 mL培养液，制成细胞悬液，将细胞悬液移入细胞培养瓶中，放于37℃、5%CO2分压的细胞培养箱中培养。细胞培养过程中，常规隔天换液。待细胞铺满瓶底后吸出培养液，用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。使用第三代细胞进行实验。 用成骨诱导液将 EGCG 配制为：0、1、10、20、30、40 μmol/L。

1.2.2 细胞增殖分析 经0.25%胰蛋白酶消化的第三代干细胞，以细胞数5×104个/mL接种于96孔培养板中， 每孔 100 μL， 孔中分别加入浓度为 0、1、10、20、30和40 μmol/L的EGCG+成骨细胞诱导液，在37℃，体积分数5%CO2条件下培养；以未行EGCG培养的为空白对照。分别在第 1、4、7、10 天向每孔加入 10 μL的CCK-8溶液，将细胞培养板在培养箱内孵育1 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.2.3 矿化结节染色 经0.25%胰蛋白酶消化后的第三代细胞，以细胞数2.5×105个/mL，接种于2块24孔板中，每孔1 mL，待细胞铺至孔底70%以上时，更换浓度依次为 0、1、10、20、30 和 40 μmol/L 的EGCG+成骨细胞诱导液，常规3 d换液1次。分别于诱导培养7 d和14 d吸去培养液，PBS洗 2遍，4% 多聚甲醛固定30 min。采用茜素红和硝酸银两种方法染色，观察矿化结节的形成情况，照相保存结果。

1.2.4 提取细胞蛋白 经0.25%胰蛋白酶消化后的第三代细胞，以细胞数2×106/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞铺至孔底70%以上时，更换浓度依次为 0、1、10、20、30 和 40 μmol/L 的 EGCG+成骨细胞诱导液，常规3 d换液1次。分别于诱导培养7 d和14 d吸去培养液，提取细胞蛋白，测定蛋白浓度后置于-70℃冰箱中保存备用。

1.2.5 血管内皮生长因子分泌量测定 分别取7 d和14 d提取的蛋白液，于血管内皮生长因子（VEGF）ELISA酶标板每孔中各加入标准品（标准品浓度分别为 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/mL）或待测样品100 μL，将反应板充分摇匀后在37℃水浴锅中培养40 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干；每孔中加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外），将反应板充分摇匀后37℃水浴锅中培养20 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干；每孔中加入酶标抗体工作液100 μL，将反应板置于 37℃水浴锅中培养 10 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干；每孔中加入底物工作液100μL，置于37℃在暗处反应15min；每孔加入100 μL终止液摇匀，于酶标仪上450 nm处测定吸收度值，并根据标准曲线计算样品中VEGF的含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS18.0统计学软件处理数据，计量资料以（x±s）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对成骨细胞增殖的影响

见图1。加入EGCG第1天开始出现增殖现象，随着培养时间的进展以（10～20）μmol/L浓度组之间增殖作用最强，明显高于0 μmol/L浓度组。而在30 μmol/L浓度组增殖率开始下降，40 μmol/L浓度组增殖率明显下降，说明高浓度EGCG对大鼠成骨细胞有抑制作用。各检测时间点不同EGCG浓度组间比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。此实验至少重复三次，均得到相似的结果。

2.2 矿化结节染色分析

见图2。成骨诱导培养7 d和14 d后，分别用茜素红染色和硝酸银染色，可见（10～20）μmol/L浓度组矿化结节数量明显多于其他浓度组。各浓度组间矿化结节数量比较，差异有统计学意义（P<0.001）。此实验至少重复三次，并且均得到相似的结果（使用图像处理系统ImageJ对矿化结节沉积区域进行量化），见表2。

图1 CCK-8分析成骨细胞在不同浓度EGCG中培养1 d、4 d、7 d、10 d细胞增殖结果

表1 CCK-8细胞增殖-毒性试验数据（450 nm处的吸光度）（x±s）

图2 EGCG对成骨细胞矿化的影响

表2 矿化结节数量 （x±s，个/孔）

2.3 ELISA测定VEGF含量

见图3。在不同浓度EGCG培养液中培养成骨细胞，血管内皮生长因子（VEGF）含量同一时间点1 μmol/L EGCG浓度组和空白对照组相比开始出现轻微的促进作用，（10～20）μmol/L浓度组表现出明显的促进作用，而30 μmol/L及以上浓度组则开始出现抑制作用；随着培养时间的延长，（10～20）μmol/L浓度组 VEGF含量明显高于其他各组，40 μmol/L浓度组的抑制作用更加明显；差异具有统计学意义（P<0.001），见表3。此实验至少重复三次，均得到相似的结果。

图3 ELISA测定VEGF含量

表3 ELISA测定VEGF含量（450 nm处的吸光度）（x±s）

3 讨论

随着老龄人口的逐渐增加，骨质疏松症发生率出现大幅度提高，严重影响着老年人的生活质量。国内外的研究已证明氧化应激与骨质疏松发病有着重要联系，体内的成骨细胞、破骨细胞等氧敏感细胞的活性和功能均受氧化应激产生的活性氧（reactive oxygen species， ROS）的影响[4]。

成骨细胞与破骨细胞的细胞功能的动态平衡是保证骨骼正常生长的重要前提，当这种平衡被氧化应激所产生的活性氧打破时，成骨细胞凋亡增加，成骨细胞数量减少[5-7]，破骨细胞凋亡被抑制[8-11]，导致骨质疏松的发生。

绿茶通过其茶多酚的抗氧化和清除自由基的活性可以起到调节内分泌系统、免疫系统、调节食欲及大脑功能的作用[12]，常喝绿茶被证实可以降低多种疾病的发生率，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、过敏症、哮喘、关节炎、神经系统疾病和肥胖症等[13-16]。国外研究表明经常喝绿茶习惯的绝经期妇女，其骨密度高于不经常喝茶的绝经期妇女[17-19]。同时在台湾也有类似的相关报道[20]。

在分子生物学机制方面，有研究显示EGCG是可以通过目前已知的控制骨骼发育和骨量的最重要途径Wnt/β-catenin信号通路来增加ALP活性从而提高成骨细胞的活性[21]。对于破骨细胞的研究显示EGCG通过抑制基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9来抑制破骨细胞的活性[22]。

本研究结果显示：当体外培养成骨细胞的环境中存在较低浓度（1 μmol/L）EGCG时，对成骨细胞的生长仅出现轻微的促进作用；当EGCG浓度达到（10～20）μmol/L时表现为对成骨细胞明显的促进增殖的作用，并且这种促进增殖的作用有随着作用时间的延长而增强的趋势，说明该浓度是对成骨细胞最佳的促进浓度；当EGCG浓度达到30 μmol/L及以上时出现对细胞的毒性反应，表现为对成骨细胞生长的抑制作用，同样抑制作用随时间的延长而增强。

根据本研究结果，当血浆中存在低浓度的EGCG时，开始表现出促进成骨细胞增殖分化的作用，当浓度达到（10～20）μmol/L时，这种促进增殖的作用最明显，证明该浓度为对体外培养成骨细胞的最佳促进浓度，因此可以认为老年人每天有规律的饮用绿茶以增加血浆EGCG浓度，从而有效刺激成骨细胞增殖分化，并最终矿化形成骨组织。但是饮用绿茶的量需要适当，当超过促进浓度后，EGCG对成骨细胞的抑制作用开始出现，将会适得其反。

综上所述，EGCG可以作为成骨细胞生长促进因子，为防治骨质疏松提供了一条新途径。

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