苜蓿叶蛋白酶解物抗氧化活性研究

王宇

摘要：以苜蓿叶蛋白粉为原料，利用碱性蛋白酶水解制备寡肽。研究了不同水解度（DH）的苜蓿叶蛋白酶解物抗氧化活性。结果表明：水解度分别为15. 42%、17. 28%、19. 35%、21. 60%、22. 32%、22. 78%的苜蓿叶蛋白寡肽溶液对二苯代苦味肼基自由基（DPPH）清除能力随水解度的增大呈现先逐渐上升后下降的趋势，在酶解物浓度为2 mg/mL时，水解度为21. 60%时，苜蓿寡肽对DPPH清除作用最强为85. 78%。

关键词：苜蓿叶蛋白；碱性蛋白酶；水解度；抗氧化活性

中图分类号：TS201.2

文献标识码：A

文章编号：2095-9737（2018）08-0003-02

紫花苜蓿为豆科苜蓿属多年生草本植物。苜蓿叶产量高，叶蛋白中粗蛋白质含量为32%～65%，且蛋白质的氨基酸种类齐全、组成合理，属优质蛋白。但大多提取后的植物叶蛋白由于溶解度较低，很难添加在乳品、饮料、糖果等食品体系中加以利用。而且植物蛋白具有一定的抗原性，其消化率和生物效价远不及牛奶、鸡蛋等动物蛋白[1]，这些都限制了植物叶蛋白的利用。通过用酸、碱或酶法对叶蛋白改性，降低蛋白分子的相对质量，对于提高其溶解性、起泡性、乳化性等功能特性、改善其口感和营养价值都具有十分重要意义。大量研究表明，蛋白质水解物多具有较好的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂使用[2]。有试验证明苜蓿叶蛋白具有很好的生理保健功能[3]，如选择适当的蛋白酶体外水解苜蓿叶蛋白，就有可能释放出有活性的肽段，制备出具有特定生理功能的活性肽。因此选用来源丰富的苜蓿叶蛋白为原料研究开发叶蛋白酶解物具有重大意义。本研究采用碱性蛋白酶对苜蓿叶蛋白进行不同条件的水解，得到不同水解度的苜蓿叶蛋白酶解物，测定其抗氧化活性，为进一步开发和利用苜蓿叶蛋白提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

苜蓿叶蛋白（蛋白质含量78. 23%）碱提酸沉法制备；碱性蛋白酶（ Protamex）上海源叶生物科技有限公司，酶活力10万u/g；二苯代苦味肼基自由基（DPPH -） Sigma公司，无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、盐酸等，天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯。

设备包括DS-1高速组织捣碎机，上海标本模型制造厂；80 1台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；PHS- 25（数显）pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FD -1真空冷冻干燥机、SHZ- 82水浴恒温振荡器，金坛市亿能试验仪器厂；722N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱性蛋白酶水解苜蓿叶蛋白制备寡肽工艺

将一定浓度的苜蓿叶蛋白溶液，置于温度为50℃水浴中预热处理30 min。处理后调节至碱性蛋白酶适宜的反应温度和pH值。随着水解反应的进行，酶解液的pH值逐渐下降，滴加1.0 mol/L NaOH溶液保持蛋白酶最适pH值不变，记录消耗NaOH溶液用量。100℃沸水中灭酶保持10 min。取出迅速冷却，4000 r/min离心20 min，取上清液，冷冻干燥，计算不同酶解条件的蛋白质水解度。

本实验进行了两个单因素实验：

配制底物浓度为5%的苜蓿叶蛋白溶液，将pH值分别控制在7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.O，温度为50℃，酶添加量1000 u/g，水解3h，灭酶，离心取上清液冻干。计算其水解度。

配制底物浓度为5%的苜蓿叶蛋白溶液，将温度分别控制在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH值为8.5，酶添加量1000 u/g，水解3h，灭酶，离心取上清液冻干。计算其水解度。

1.2.2 对二苯代苦味肼基自由基清除能力的测定

研究不同水解度的苜蓿叶蛋白酶解产物对DPPH 清除能力的影响，初步确定水解度与抗氧化活性的关系。

1.3 测定方法

1.3.1 水解度的测定采用pH-Stat法[4]。

1.3.2 蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法[5]。

1.3.3 二苯代苦味肼基自由基（ DPPH-）清除能力的测定：

参考Shimadac6]的方法略作改动。各取2 mL待测样品溶液（质量浓度为0—2.5 mg/mL），依次与2.0 mL浓度为0. 04 g/L的DPPH 无水乙醇溶液室温避光反应30 min，在517 nm处测吸光值Ai。另取2 mL待测样品与2 mL无水乙醇避光反应20 min，在517 nm处测吸光值Aj；以2 mLO.04 g/L DPPH 无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇反应作为参比，其吸光值为A0。可以按照下列公式计算待测样品对DPPH 的抑制率。

2 结果与分析

2.1 碱性蛋白酶水解苜蓿叶蛋白制备寡肽

在兩个单因素实验中，本论文选择了水解度有一定差异的6个苜蓿叶蛋白酶解物。其酶解条件及水解度结果见表1。

2.2 不同水解度酶解产物的抗氧化活性的研究

碱性蛋白酶作用于苜蓿叶蛋白不同时间而得到的酶解产物的肽链结构和长度不同，其活性可能不同。通常期望得到的是具有特定功能的分子量较小的寡肽，若单纯追求高水解度指标，虽然产生较多的游离氨基酸，但疏水性氨基酸含量可能不多，其活性不一定高，因此本论文研究不同酶解物的抗氧化活性，以探讨水解度与抗氧化活性之间的关系。

大多数自由基反应活性较强而寿命短暂，DPPH 即使在室温条件下也能保持稳定，用DPPH 清除能力反映被测物的抗氧化活性操作简便、快速、灵敏。因此本研究考察了不同DH的苜蓿叶蛋白酶解产物对DPPH 清除能力的影响，其结果见图1。

由图1可知，不同DH的苜蓿叶蛋白解物对DPPH清除能力均随底物浓度的增加而提高，当浓度为2.o mg/mL时，抑制率在50%—90%之间，显示出较强的DPPH清除能力。这是因为样品浓度越高，其中所含有的抗氧化性的氨基酸短肽就越多，从而抗氧化性就越强。DPPH清除力也随着DH的增大而逐渐增大，当DH为21. 60%时达到最高（85.78%），然后随着DH的升高而逐渐下降。这说明酶解产物的抗氧化性与其DH有关，水解度大小对肽段长短和游离氨基酸的相对含量是至关重要的，如水解度太小，则肽段过长，具有抗氧化性的一些氨基酸未能断裂，抗氧化性较低；如水解度太大，虽游离氨基酸含量过高，但疏水性氨基酸含量下降而导致抗氧化性降低。所以，控制适当的水解度可以获得较高抗氧化性活性的苜蓿叶蛋白肽。

3 结论

本研究进行了pH值和温度两个复合蛋白酶水解苜蓿叶蛋白制备寡肽的单因素实验，最终选取水解度有一定差异的6个苜蓿叶蛋白酶解物作为研究对象。通过抗氧化活性实验得出，不同DH的苜蓿叶蛋白解物对DPPH 清除能力均随底物浓度的增加而提高，当浓度为2.o mg/mL时，抑制率在50%—90%之间，显示出较强的DPPH 清除能力。DPPH 的清除力也随着DH的增大呈现先升高后逐渐下降的趋势。所以说明水解度和抗氧化活性有一定关系，但并非正相关，控制适当的水解度可以获得抗氧化性活性较高的苜蓿叶蛋白肽。

参考文献：

[1]杨春波，苜蓿叶蛋白的提取与应用研究[D].无锡：江南大学，2007.

[2] Di Bernardini R， Harnedy P，Bolton D， et aI.Antioxidant and antimicrobial peptidic hydrolysates from muscle proteln sources and by- products [Jl. Food Chemistry， 2011，124（4）：1296 - 1307.

[3]田丽萍，刘青广，薛琳，苜蓿蛋白营养价值的初步研究[J]，饲料工业，2005，26（5）：56-59.

[4] Sako K， Imamura Y， Nishimata H，et al.Branched-chain amino acids supplements in the late evening decrease the frequency of muscle cramps with advanced hepatic cirrhoss[J]. HepatolRes，2003，26（4）：327-329.

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