地稔根际根腐线虫的形态和分子鉴定

王宏洪 黄少彬 杨晓朱 廖金铃

摘 要 2013—2016年，广东和广西植物线虫种类调查期间，从地稔（Melastoma dodecandnun）根部和根际土壤中分离到一种根腐线虫。经形态学观察、rDNA （LSU D2D3和ITS） 序列分析和系统发育分析，将其鉴定为最短尾短体线虫（Pratylenchus brachyurus）。最短尾短体线虫是全球最重要的11种根腐线虫之一。地稔是最短尾短体线虫的新寄主。地稔根际线虫类群调查与鉴定，可为地稔线虫病害的发生与控制提供数据基础。

關键词 地稔；最短尾短体线虫；根腐线虫；形态学；新寄主

中图分类号 S432 文献标识码 A

Abstract A species of root lesion nematode was isolated from the root of Melastoma dodecandrum and the rhizosphere soil during the survey of plant nematodes in Guangdong and Guangxi. Combined morphological study， sequence analysis of rDNA （LSU D2D3 and ITS） and phylogenetic analyses revealed the species was Pratylenchus brachyurus. P. brachyurus is one of the 11 most important root lesion nematodes in the world. M. dodecandrum is a new host record for P. brachyurus. The investigation and identification of plant nematodes assocated with M. dodecandnun can provide a basis for controlling the diseases.

Keywords Melastoma dodecandrum； Pratylenchus brachyurus； root-lesion nematode； morphology； new host record

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.021

短体线虫（Pratylenchus spp.）是迁移性根内寄生线虫，通常被称作根腐线虫，能够穿刺和取食皮层薄壁细胞，引起根部坏死，阻碍水分和营养的吸收与运输，导致根系统功能丧失[1]。由根腐线虫引起的损伤可作为病原菌侵入的通道，致使寄主根部的大面积腐烂，形成更加严重的复合病害[2]。根腐线虫种类繁多，形态多样，寄主广泛，是一类危害仅次于根结线虫（Meloidogyne spp.）和孢囊线虫（Heterodera spp. 和Globodera spp.）的植物寄生线虫[3]。

地稔（Melastoma dodecandnun Lour.）为野牡丹科植物，俗名山地稔、地葡萄、铺地锦、落地稔和地茄等，分布于广东、广西、贵州、湖南、江西、浙江、福建等地区，生于酸性土壤的山坡路旁[4]。地稔有良好的药用价值，味甘、涩，性另外，地稔还被认凉，具有活血止血、消肿祛瘀和清热解毒的功效[5]。为是一种优良的野生观花地被植物[6-7]。目前，尚未见地稔病虫害的报道[8]。2013—2016年，广东和广西植物线虫的调查期间，在地被植物地稔根际采集了6个土壤样品，其中2个样品中发现根腐线虫，本研究通过形态学观察和分子生物学分析将其鉴定到种。

1 材料与方法

1.1 种群来源

样品采自广东石门国家森林公园（2016年6月，广州市从化区）和广西农垦国有新光农场（2013年6月，钦州市灵山县）。用小铁铲在成片地稔中央挖取根系，以及表层10 cm根际土壤约500 g。样品装于塑料自封袋，写好标签，做好GPS定位，广东种群SMDL（23°39′10.25″N，113°45′16.30″E）和广西种群GX630（22°17′ 25.52″N，108°53′ 30.06″E）。

1.2 方法

1.2.1 线虫分离、标本制作、形态观察与测量 土壤混匀后称取200 mL，根系剪成0.5 cm小段后称取2 g，经改进的贝曼漏斗法分离24～48 h。在体式显微镜下，将根系和土壤样品中的分离到的根腐线虫挑入装有清水的指形管中。经热杀死（60～65 ℃水浴2～3 min）、4%甲醛固定和甘油酒精法脱水后，用蜡圈法进行标本制作[9]。利用尼康科研级正置显微镜（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）对线虫标本进行形态观察、数据测量和拍照[10]。

1.2.2 DNA抽提、扩增和测序 采用蛋白酶K法进行单条线虫DNA抽提[11]。LSU D2D3扩增引物为D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3′）和D3B （5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′） [12]，ITS扩增引物为18S （5′-TTGATTACGTCCCTG-CCCTTT-3′）和26S（5′-TTTCACTCGCCGTTA-CTAAGG-3′）[13]。PCR反应体系参照Ex Taq酶说明书（Ex Taq?，TAKARA，日本），50 μL PCR体系中DNA模板为4 μL。PCR程序：95 ℃ 预变性5 min，（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min）39个循环，72 ℃ 10 min。PCR结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒切胶回收PCR产物（EasyPure PCR Purification Kit，全式金生物，北京）。纯化的rDNA片段克隆到T载体（PMD-18T vector，TAKARA，日本），再转化到DH5α菌株后，挑取阳性克隆送至艾基生物技术（广州）有限公司测序。利用Lasergene 7.0软件对测序结果进行分析和拼接，然后上传至GenBank数据库，序列号分别为MG745329（广东种群 28S rDNA D2D3）、MG745330 （广西种群

28S rDNA D2D3）、MG738355（广东种群 rDNA- ITS）和MG738356（广西种群 rDNA-ITS）。

1.2.3 系统发育关系分析 参考已发表的短体线虫系统发育研究文献[14-16]，下载短体线虫rDNA （LSU D2D3和ITS）序列。利用MEGA 6.0进行序列比对，PAUP 4.0和Modeltest 3.7选择核酸替代模型，MrBayes 3.2构建系统发育树、Treeview 1.6打开和编辑系统发育树[10]。基于28S rDNA D2D3区系统发育树的外组选择参考Wang等[11]，基于rDNA-ITS区系统发育树的外组选择刻痕短体线虫[Pratylenchus crenatus Loof， 1960 （FJ712912）]。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定

形态特征图片见图1，形态测量值见表1。

雌虫（SMDL种群）：热杀死后虫体略腹弯。唇区略缢缩，前缘明显呈角状，唇环两个。侧区四条侧线，偶尔中带多出一条线纹，宽5.6～ 8.8 μm。头骨架强，骨化部分延伸至体部两个环纹。口针粗壮，长18～19.2 μm，基部球大，圆球形，宽4～4.9 μm，高2.7～3.8 μm。食道腺覆盖肠道的腹面，覆盖长度为35.8～68.6 μm，排泄孔紧靠于半月体后，略后于食道腺与肠连接位置，至体前端距离为89.7～107.9 μm。卵母细胞单行排列，受精囊不清楚，卵巢长度为141.3～231.2 μm。后阴子宫囊短，长11.6～22.9 μm，小于最大体宽。阴门位置相对靠后，V值为83.9～87.9。尾圆柱形或亚圆柱形，末端宽圆或平，光滑，有时角质层增厚，侧尾腺口位于尾中部，至尾末端距离为15.5～20.6 μm。

雄虫：未发现。

寄主：地稔（Melastoma dodecandnun Lour.）。

经形态学特征和测量值比较，地稔根际的根腐线虫（广东种群SMDL和广西种群GX630）与最短尾短体线虫基本吻合，故将地稔根际的两个短体线虫种群均鉴定为最短尾短体线虫[17]。

2.2 分子鉴定

广东种群SMDL的LSU D2D3区和ITS序列长度为780 bp（图2），与GenBank数据库最短尾短体线虫序列的一致性为97.2%～99.6%；ITS区序列长度为920 bp（图2），与GenBank数据库最短尾短体线虫序列的一致性为93.7%～99.0%。广西种群GX630的LSU D2D3区序列长度为780 bp，与GenBank数据库最短尾短体线虫序列的一致性为97.1%～99.9%；ITS区序列长度为919 bp，与GenBank数据库最短尾短体线虫序列的一致性为93.1%～99.8%。广东种群SMDL和广西种群GX630的LSU D2D3区序列一致性为98.8%，ITS序列一致性为98.9%。

分子序列分析结果表明，地稔根际的根腐线虫（广东种群SMDL和广西种群GX630）均为最短尾短体线虫。

2.3 系统发育分析结果

基于LSU rDNA D2D3和rDNA-ITS的短体线虫系统发育樹（图3，图4）均显示，本研究获得的最短尾短体线虫序列与已发表的同物种序列聚为高度支持的分支（PP=100），进一步证明本研究获得的短体线虫种群为最短尾短体线虫。

3 讨论

地稔作为一种地被植物，具有良好的园林观赏应用价值，其药用活性成分也有待开发，但人工栽培的地稔尚未有病虫害发生相关报道[8]。本文首次报道了地稔根际线虫类群，地稔是最短尾短体线虫的新寄主，其对地稔的致病性有待进一步研究。

最短尾短体线虫是11种重要短体线虫之一，寄主植物种类丰富，严重影响植物的生长[3]。我国已有最短尾短体线虫的报道[18-19]。地稔可生长在山坡地或者阳光照射到的林间和田间的酸性土壤中，生长迅速[4]，广西种群GX630采自星光农场的荔枝果园，最短尾短体线虫也危害荔枝[3]。因此，在一些能够受到最短尾短体线虫危害的农作物周围，应该及时铲除地稔，以阻止地稔携带的最短尾短体线虫传播。

短体线虫种内ITS区变异较大[15-16]，一般情况下为1%～3%，部分种类达到6%～8%。例如：玻利维亚短体线虫（P. bolivianus Corbett， 1983）、地中海短体线虫（P. mediterraneus Corbett， 1983）和假咖啡短体线虫（P. pseudocoffeae Mizukubo， 1992）为1%；扁豆短体线虫（P. lentis Troccoli， De Luca， Handoo & Di Vito， 2008）为5%；桑尼短体线虫（P. thornei Sher & Allen， 1953）和铃兰短体线虫（P. convallariae Seinhorst， 1959）为6%；伤残短体线虫（P. vulnus Allen & Jensen， 1951）为6%[15]或7%[16]；落选短体线虫[P. neglectus （Rensch， 1924） Filipjev & Schuurmans Stekhoven， 1941]和刻痕短体线虫为 7%；穿刺短体线虫[P. penetrans （Cobb， 1917） Filipjev & Schuurmans Stekhoven， 1941]、敏捷短体线虫（P. agilis Thorne & Malek， 1968）和最短尾短体线虫的ITS变异就达到8%[15] 。本研究中，广东种群GX630的ITS区序列与GenBank数据库最短尾短体线虫序列的一致性为93.1%～99.8%，ITS区变异达到了6.9%，在最短尾短体线虫种内ITS变异范围之内。据报道，短体线虫ITS区种内变异大的原因有两个，一是短体线虫ITS1和ITS2的碱基序列和长度变异大，二是短体线虫的ITS序列是有记录的植物线虫中最短的[16]，在870～1 250 bp之间。碱基序列变异越大或者ITS序列越短，相对变异越大。而最短尾短体线虫的ITS序列仅有920 bp，属于较短ITS序列的短体线虫。

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