接触刺激在水稻根不对称生长中的作用

杨文 于旭东 蔡泽坪 罗佳佳 孟帅良

摘 要 为探究接触刺激与2，4表油菜素内酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）诱导的水稻（Oryza sativa L.）根不对称生长之间的关系，本研究采用悬吊培养法和根冠蘸蜡法模拟接触刺激的有无。结果表明：仅有2，4-eBL或接触刺激存在时，水稻根不对称生长比例较低，不超过9.7%；而当2，4-eBL和接触刺激同时存在时，水稻根不对称生长比例高达90.7%。采用根冠蘸蜡法模拟接触刺激也得到类似结果。本文研究外源施加2，4-eBL诱导水稻根不对称生长的现象及在此过程中接触刺激发挥的关键作用，为探究油菜素类固醇（Brassinosteroids，BRs）与接触刺激之间的关系提供新见解。

关键词 接触刺激；油菜素类固醇；水稻；根；不对称生长

中图分类号 S59 文献标识码 A

Abstract To investigate the relationship between contact stimuli and asymmetric growth of rice （Oryza sativa L.） roots induced by 2，4-Epibrassinolide（2，4-eBL）， the suspension culture method and the root cap dipping wax method were used to simulate the presence or absence of contact stimulation. When only 2，4-eBL or contact stimuli were found， the proportion of asymmetric growth of rice roots was low， not more than 9.7%. When 2，4-eBL and contact stimuli were present at the same time， the ratio of asymmetric growth of rice root was as high as 90.7%. Simulations of contact stimuli using the root cap dipping method have also yielded similar results. This article describes the phenomenon of asymmetric growth of rice roots induced by external application of 2，4-eBL and the key role of contact stimuli in this process， providing new insights into the relationship between brassinosteroids （BRs） and contact stimuli.

Keywords contact stimuli； brassinosteroids； rice； root； asymmetric growth

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.003

油菜素类固醇（Brassinosteroids，BRs）是广泛存在于植物中的结构类似于动物固醇类激素的一种天然产物[1]。目前，人们已经发现了近70种BRs，在这些具有生物活性的BRs中，油菜素内酯（Brassinolide， BL）的活性最高[2-3]。BRs在植物体各器官中的分布不均匀，尤其在根中的含量甚微，反之，根对BRs的反应要比植物体的其他部位敏感得多[4]。微量的BRs就能影响根的生长，在水稻中低浓度的BL（≤10 nmol/L）促进根生长，高浓度的BL（>100 nmol/L）则抑制根生长[5-6]。此外，BL还能调控侧根与不定根的形成，在拟南芥中低浓度的BL（≤10 nmol/L）促进侧根和不定根的形成，高浓度的BL（>100 nmol/L）则起到抑制作用[7]。

根具有复杂的信号转导途径，能感知和响应不同的环境信号，如重力和接触刺激[8]。其中重力能调节根系向着地心引力的方向生长[9]，而接触刺激能抑制根的向地性[10]。有实验发现拟南芥在倾斜的琼脂块上生长根会发生波浪形弯曲，但在解释这一现象时并没有考虑到琼脂块对根生长的接触刺激作用[11]。此外，有研究发现2.5 mg/L乙烯（Ethylene）能诱导番茄根发生卷曲[12]。0.5 μmol/L茉莉酸（Jasmonic acid）也能诱导10%～15%水稻根发生卷曲[13]。但上述根不对称生长与根尖接触刺激是否有关尚不清楚。本研究以根尖接触刺激的有无为切入点，通过根冠蘸蜡法模拟根尖接触刺激，研究根尖接触刺激在外源施加2，4表油菜素内酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）诱导水稻根不对称生长中的关键作用，为探究接触刺激与根不对称生长之间的关系提供新见解。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻种子为“准两优2号”，由国家杂交水稻研究中心清华深圳龙岗研究所用准SxR402 杂交选配选育而成。2，4-eBL（code E-1641）购自Sigma公司，用75%乙醇溶解并配置成1 mmol/L母液。

1.2 方法

1.2.1 水稻种子灭菌及催芽 挑选颖壳不开裂且饱满的种粒500颗，置于培养皿中，用75%乙醇灭菌1 min后，自来水冲洗8～12遍，置于培养皿中并加入少量自来水，在培养间催芽2 d，挑选长势一致的水稻幼苗用于实验。

1.2.2 悬吊培养法 分别配制自来水、2×10–8 mol/L 2，4-eBL水溶液作为水稻培养液，在培养皿（? 150 mm）、烧杯（1 000 mL）中分别加入200、700 mL。将挑选好的水稻种子用玻璃胶整齐地粘于竹签上，将粘好水稻种子的竹签水平地置于培养皿、烧杯上，并使根尖半浸入培養液中。其中在培养皿中悬吊培养的水稻作2个处理：培养2 d使根尖不接触培养皿底部（处理1），培养3 d使根尖生长接触培养皿底部（处理2）。在烧杯中悬吊培养的水稻作2个处理：培养4 d使根尖不接触烧杯底部（处理3），培养4 d并采用根冠蘸蜡法模拟接触刺激（处理4）。以上每个处理均设立5次重复。

1.2.3 根冠蘸蜡法 将融化的蜡液滴在载玻片上，待蜡液即将凝固（约55 ℃）时将其快速蘸在水稻根冠上，将根冠蘸有蜡块的水稻幼苗迅速放回培养液中进行悬吊培养。

1.2.4 培养条件 温度（24±2）℃，光强1 000 lx， 光照16 h/d，黑暗8 h/d。调节培养液pH=7.0，每组均接入30棵水稻幼苗。

1.3 数据处理

水稻初生根的不对称生长比例=根发生不对称生长的水稻幼苗数/水稻幼苗总数。采用LSD法进行显著性分析，当波浪形弯曲（wave）和卷曲（coiling）同时存在时作coiling计算。

2 结果与分析

2.1 接触刺激对水稻根不对称生长的影响

结果表明，水稻初生根在2，4-eBL中只有接触培养皿底部时才会发生不对称生长。根不对称生长的类型可概括为2种模式：①wave：根呈正弦式弯曲生长，波峰、波谷交替连续出现3次以上（图1-E）；②coiling：根绕中心轴连续旋转一圈以上（图1-D）。wave与coiling卷曲可同时出现于同一根中（图1-F）。

将水稻幼苗在自来水中进行悬吊培养，2 d后根尖未接触培养皿底部时，水稻初生根直立向下生长，即在2，4-eBL与接触刺激均不存在时，水稻初生根正常生长的比例为100%，不发生不对称生长。而当3 d后根尖接触培养皿底部时，在自来水条件下培养的水稻初生根发生轻微的不对称生长。即在仅有接触刺激无2，4-eBL的条件下，水稻初生根发生wave的比例为9.7%，不发生coiling，总不对称生长比例为9.7%（表1和图1-A）。

将水稻幼苗在2×10–8 mol/L 2，4-eBL中进行悬吊培养，2 d后根尖未接触培养皿底部时，水稻初生根发生低比例的不对称生长。即在仅有2，4-eBL无接触刺激的条件下，水稻初生根发生wave的比例为4.9%，无coiling，总不对称生长比例为4.9%。而当3 d后根尖接触培养皿底部时，在2×10–8 mol/L 2，4-eBL和接触刺激同时存在的条件下，水稻初生根不对称生长比例大幅提高，wave和coiling的比例分别为16.5%和74.2%，总不对称生长比例上升到90.7%（表1和图1-B）。

综上所述，在2，4-eBL和接触刺激均存在的情况下，coiling才能发生，且在此情况下wave和总不对称生长的比例大幅提高，分别为仅有接触刺激条件的1.7、9.4倍，僅有2，4-eBL条件的3.4、18.5倍。

2.2 根冠蘸蜡法模拟接触对水稻根不对称生长的影响

将水稻幼苗在自来水中进行悬吊培养，4 d后根尖未接触烧杯底部时，水稻初生根正常生长。

即接触刺激与2，4-eBL均不存在时，wave和coiling的比例均为0，总不对称生长比例为0（表2和图2-A）。而当根冠蘸蜡的水稻初生根在自来水中培养悬吊培养4 d后，水稻初生根不对称生长情况与水稻在自来水中接触培养皿底部时的不对称生长情况类似。即在只有接触刺激的条件下，水稻初生根仅发生轻微的wave比例为8.6%，不发生coiling，总不对称生长比例为8.6%（表2和图2-C）。

将水稻幼苗在2×108 mol/L 2，4-eBL中进行悬吊培养，4d后根尖未接触烧杯底部时，水稻初生根发生低比例的不对称生长。即在只有2，4-eBL无接触刺激的条件下，发生wave的比例为6.5%，不发生coiling，总不对称生长比例为6.5%（表2和图2-B）。而当根冠蘸蜡的水稻初生根在2×108 mol/L 2，4-eBL溶液中培养悬吊培养4 d后，水稻初生根的不对称生长情况与水稻在2，4-eBL中接触培养皿底部时的不对称生长情况相似。即在接触刺激和2，4-eBL同时存在的条件下，水稻初生根发生高比例的不对称生长，wave和coiling的比例分别为36.7%和28.5%，总不对称生长比例为65.2%（表2和图2-D）。

综上所述，在2，4-eBL和根冠蘸蜡均存在的情况下coiling才发生，且在此情况下wave和总不对称生长比例大幅提高，分别为仅有根冠蘸蜡条件的4.3和7.6倍，仅有2，4-eBL条件的5.6和10.0倍。

从图3可看出，在wave和coiling两种不对称生长模式中包含着许多不对称生长情况。如逆时针卷曲、逆时针后顺时针卷曲、顺时针后逆时针卷曲、无规则卷曲、一大一小卷曲、根绕根卷曲等。当水稻根尖接触培养皿底部时，2，4-eBL不仅能诱导初生根不对称生长，还能诱导之后生出的所有不定根也发生不对称生长（图3-I）。说明2，4-eBL对所有的水稻根作用效果相同。

3 讨论

本研究结果表明，2，4-eBL能诱导水稻初生根不对称生长发生wave和coiling，但此过程还需要接触刺激的参与。如果水稻根尖未受到接触刺激，即使在2，4-eBL条件下水稻初生根不对称生长的比例仍较低。这说明接触刺激在根的不对称生长过程中起着关键作用。为了验证这一结论，采用根冠蘸蜡法模拟接触刺激，结果发现在自来水条件下仅少量根发生wave，无coiling，而在2，4-eBL条件下，大部分根发生不对称生长形成wave和coiling。

在本研究中，采用根冠蘸蜡的方法模拟接触刺激，在蘸蜡过程中要注意蜡块只需适量接触到水稻根冠即可，如果过量接触到分生区或伸长区则会影响根的生长。同时，还需注意蘸蜡时蜡块的温度应控制在54～57 ℃，因为过高的温度会导致根活力下降，影响实验结果[14]。此外，根冠蘸蜡是保持根尖接触刺激的一种温和的实验方法，所以在根生长过程中会有一部分蜡块脱落，导致根冠蘸蜡诱导的根不对称生长比例小于接触瓶底诱导的根不对称生长比例。

在自来水中水稻根尖接触瓶底/根冠蘸蜡后，初生根会发生一定程度的弯曲，但这种弯曲是水稻根尖遇到障碍物后的自然现象[15]。而2，4-eBL诱导的wave和coiling是根有规律的不对称生长，两者在形态上有很大区别，易于区分。

在自来水中水稻根尖接触瓶底或根冠蘸蜡后，初生根会发生低比例的wave。对于此现象，有研究认为是因为生长的根尖受到重力的作用向下倾斜，而随着伸长区的不断增长，根尖端和基质之间反复接触，这些重复的接触刺激将导致根部生长朝相反的方向重新定向，从而产生扭曲的旋向变化[8， 11]。此外，也有研究表明wave的产生是由于根无法穿透基質，因此向一侧发生横向生长，而重力会纠正这个轨迹使根向另一个方向生长，从而产生弯曲[11， 16]。上述研究中的基质与本研究中的蜡块本质上是一样的。

目前为止，BRs导致根不对称生长发生wave和coiling的机理还仍然未知。接触刺激为何会改变根对BRs的生理反应也尚不清楚。因此这些都将是今后研究的重点，其分子机理也有待进一步探索。本研究发现水稻根不对称生长的大量发生需要BRs和接触刺激的共同作用，并发现接触刺激能促进BRs导致的水稻根不对称生长，为了解BRs与接触刺激之间的关系提供理论基础。

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