甘蔗根际土壤AM真菌群落季节性变化研究

汪茜 冯重阳 张金莲 宋娟 袁照年 黄京华 陈廷速

摘 要 为了探明甘蔗根际土壤 AM 真菌群落季节性变化规律及其影响因素，2016年4月、8月、10月和12月在里建甘蔗试验基地，采集4个施肥水平（0%、25%、50%、100%）下的甘蔗根际土壤，采用高通量测序技术分析不同施肥水平下AM 真菌群落季节变化规律。结果表明：4个季节共检测到10属AM真菌，AM真菌Chaol、Shannon-Wiener指数Shannon-Wiener和Invsimpson index指数从春季到冬季呈先降后升的趋势，夏季最低；4个季节共检测出281个AM真菌OTUs（operational taxonomic units），春季、夏季、秋季、冬季的OTUs数目分别为160、68、103、198个。4个季节甘蔗根际土壤中球囊霉属（Glomus）占有绝对的优势，之后是类球囊霉属（Paraglomus）和多样孢囊霉属（Diversispora）。此外，也有少量的原囊霉属（Archaeospora）、巨孢囊霉属（Gigaspora）、无梗囊霉属（Acaulospora）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）和两性球囊霉属（Ambispora）。不同季节AM真菌群落组成差异显著，但总体来说冬季和春季种群结构相似，夏季和秋季相似，而夏季和秋季的AM真菌种类比春季和冬季的AM真菌种类多。

关键词 AM真菌；群落；季节性变化；甘蔗；高通量测序

中图分类号 S154.3 文献标识码 A

Abstract In this paper， four seasonal variation of AM fungal community in the rhizosphere of sugarcane was investi-gated by Illumina MiSeq and influencing factors were analyzed. Soil samples were collected from the rhizosphere of sugarcane plants under four different fertilization levels （0%， 25%， 50% and 100%） in April， August， October and De-cember 2016， respectively. A total of 10 genera of AM fungi were discovered. Shannon-Weiner indices， richness and Simpson Index of AM fungi decreased first and then increased from spring to winter， lowest values occurred in summer. A total of 281 AM fungal OTUs （operational taxonomic units） were detected in four seasons， with 160 OTUs， 68 OTUs， 103 OTUs， and 198 OTUs in spring， summer， autumn and winter， respectively. Glomus was the most dominant genus in the soils in the study， followed by Paraglomus and Diversispora. A small number of Archaeospora， Gigaspora， Acau-lospora， Scutellospora and Ambispora species were also identified. AM fungal community compositions in summer and autumn were significantly different from that of spring and winter， while the difference was not significant between summer and autumn. AM fungi species in summer and autumn were more than those in spring and winter.

Keywords arbuscular mycorrhizal fungi； community； seasonal variation； sugarcane； Illumina MiSeq

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.002

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）是由球囊霉（Glomeromycota）真菌与植物根系形成的互惠共生体，是自然界中最普遍的一种菌根类型，与约20万种植物都能形成丛枝菌根[1-4]。AM真菌与植物根系共生后，可促进植物吸收养分[5]，不仅能通过提高植物对养分的吸收，达到使作物增产提高其经济效益的目的，还可以修复土壤[6-8]，能减少化肥的使用量，提高农作物产量，而且在提高植物的抗逆性、抗病性以及改善根际生态位的养分组成和微生物群落结构等方面也发挥着关键作用[9-10]。

甘蔗是我国重要的糖料作物。由于缺乏宿根性优良的品种、品种单一、品种退化、地力下降以及甘蔗生产条件总体较差等原因，中国的甘蔗产量长期停留在较低水平，加之近年来干旱对甘蔗产业的影响日趋严重[11]，因此，如何提高甘蔗的产量和抗逆性成为我国甘蔗产业发展中急需解决的问题。我国多数蔗区由于多年连作和过度施用化肥造成严重的土壤退化问题，已无法通过增施化肥来提高产量。过量施用化肥不仅没有提高甘蔗产量[11-13]，而且造成了土壤板结、结构性变差、酸化、保水保肥能力降低等严重的问题，对环境造成了巨大的压力[14]。多项研究证明，AM真菌能够促进甘蔗生长，并改善蔗园土壤生态。接种AM真菌的甘蔗根系较发达，株高、绿叶数和茎径均比对照有明显优势，且耐旱性能有所增强[15-17]；AM真菌能够提高蔗园土壤pH，促进根系对土壤营养物质的吸收，提高甘蔗产量10%～ 24%，减少化肥用量30%以上[12]。AM真菌的分布、侵染、产孢及其生理效应受生态因子影响，尤其以土壤因子（主要包括土壤类型、pH、养分、有机质等）对AM真菌的影响较为突出[18]。因此，本研究通过高通量测序的方法，研究不同季节对不同施肥水平下的甘蔗根际AM真菌多样性及其与土壤因子的关系，以便为筛选适合甘蔗生长的高效菌种、利用菌根生物技术提高甘蔗产量和品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在广西农业科学院里建基地建立的甘蔗原位观察试验地进行，所用甘蔗品种为桂柳05-136（其亲本来源于新台糖22号）。所用肥料为西洋复合肥N：P：K=15：15：15。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 设4个不同的施肥水平，分别为0%施肥水平（底肥0 kg/hm2，追肥0 kg/hm2）、25%施肥水平（底肥187.50 kg/hm2，追肥187.50 kg/hm2）、50%施肥水平（底肥375.00 kg/hm2，追肥375.00 kg/hm2）和100%施肥水平（底肥750.00 kg/hm2，追肥750.00 kg/hm2）（按照广西甘蔗常规种植中的施肥水平）。每个施肥水平3个小区（重复），小区随机分布。每个小区长7 m，宽6.5 m，小区面积45.5 m2，行距1.3 m，种5行甘蔗（2015年1月种植）。各个相邻小区之间种植两行桂糖-29号作为隔离。

1.2.2 样品采集 分别于2016年4月、8月、10月和12月，分4次采集甘蔗根围土壤。在距离甘蔗根部约10 cm的地方，先铲去2～3 cm的表层土，然后拿铁锨铲出一个耕层断面，刮去部分断面土壤后，再平行于断面从上到下均匀取土，采样深度为0～20 cm表层土壤。每次取样均采集3个小区的土壤混合为一个土样。采集到的新鲜土样尽快带回实验室，并分成2份，1份土样放于4 ℃保存备用，1份存于–20 ℃用于后续提取土壤总DNA。土壤理化性状见表1。

1.2.3 研究方法 土壤 DNA 使用土壤基因组DNA提取试剂盒（MP biomedicals 公司）进行提取。将提取到的DNA样品经过1%琼脂糖凝胶电泳电泳检测，测定DNA样品浓度。第一次PCR反应用真核引物GeoA2 /Geo11（由上海生工生物工程技术有限公司完成），反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共进行30个循环；72 ℃延伸10 min。

第二次PCR反应以第一次PCR扩增产物为模板，用TE适当稀释。引物为AM真菌的特异性引物NS31/AML2（由上海生工生物工程技术有限公司完成）。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃退火1 min，共进行30个循环；72 ℃延伸10 min。第二轮PCR产物同样以1%的琼脂糖凝胶检测是否有大小合适的条带，将PCR样品由上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina Miseq测序。

1.3 数据处理

利用Mothur软件（1.30.1）对实测OTUs数、Chaol指数、Shannon-Wiener指数和Invsimpson指数进行rarefaction分析。为比较不同季节AM真菌群落组成的差异性，利用PCORD软件（5.0）进行主坐标分析（principal coordinate analysis，PCO）和PERMANOVA分析。利用Canoco软件（4.5）的冗余分析（redundancy analysis，RDA）描述不同季节AM真菌丰富度和多样性指数与采样季节、土壤和植被因子间的关系[19]。

2 结果与分析

2.1 不同季节AM真菌种群差异

4月、8月、10月和12月检测到的OTU数目分别为160、68、103和195个，不同季节共有和特有的AM真菌OTUs如图1所示。4个季节共有OTU数目39个，春季和冬季共有的AM真菌OTUs较多，为96个；春季和夏季共有的AM真菌OTUs较少，为44个。特有的AM真菌OTUs却表现出一样的趋势：春季和冬季较多，分别为57、69个；夏季和秋季较少，分别为6、14个。说明随着季节的变化，AM真菌丰富度呈现先减小后增加的趋势。

2.2 不同季节AM真菌种群组成

在属的分类水平上，312个OTU被分类到10个属，分别为原囊霉属（Archaeospora）、巨孢囊霉属（Gigaspora）、无梗囊霉属（Acaulospora）、类球囊霉属（Paraglomus）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）、多样囊霉科球囊霉属（Diversisporaceae Glomus）、球囊霉属（Glomus）、多样孢囊霉属（Diversispora）、两性球囊霉属（Ambispora）以及2个在属水平上无法分类的多样囊霉科unclassified_f_Diversisporaceae和未分类的球囊霉纲unclassified_c_Glomeromycetes（图2）。

各季节AM真菌种群的优势属均为球囊霉属。随着季节变化，多样囊霉属、未分类的球囊霉纲、未分类的多样囊霉科、巨孢囊霉属、原囊霉属含量基本呈下降趋势，而类球囊霉属含量秋季最多，盾巨孢囊霉属在夏、秋、冬季节含量基本保持不变。此外，未分类的多样囊霉科只存在于春季和夏季，盾巨孢囊霉属和无梗囊霉属春季中没有，多样囊霉属在冬季中没有。综上所述，春季和冬季的AM真菌种类比夏季和秋季的AM真菌种类少。

2.3 AM真菌多样性指数和丰富度分析

由表2可知，各样品多样性指数有差异。0%施肥水平AM真菌丰富度随季节的变化表现为先减小后增大再减小，總体呈现下降的趋势。25%施肥水平、50%施肥水平和100%施肥水平AM真菌丰富度随季节的变化总体上均呈上升的趋势，不同之处在于4—8月时100%施肥水平呈下降趋势。

Invsimpson指数发现，0%施肥水平和25%施肥水平在10月时多样性最高，而50%施肥水平和100%施肥水平在12月是多样性最高。

12月100%施肥水平的Shannon-wiener指数最高，达3.23；4月和8月100%施肥水平的Shannon-Wiener指数最低，分别为1.68和1.35。

2.4 不同季節的Plsda分析

不同季节的Plsda分析结果如图3所示。第一主成分（COMP1）解释了变量方差的13.54%，第二主成分（COMP2）解释了变量方差的11.76%，累计贡献率为25.3%。不同季节的样品在坐标系中分布有明显的差异，10月在P1坐标轴上与4月、8月、12月分开，4月与8月在P2坐标轴上与10月、12月分开，说明4月与8月AM真菌种群结构较为相似。

3 讨论

目前，有关AM真菌季节变化的研究大多集中于孢子形态学鉴定[20]、末端限制性长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）[21-22]、变性梯度凝胶电泳 （ dena?t?u????ring ?-gradient gel electrophoresis，DGGE）[15]等技术，利用高通量测序技术研究AM真菌群落动态的报道比较少[23-24]。本研究应用高通量测序技术评估了甘蔗根围AM真菌种群组成的季节动态。

不同季节AM真菌种群组成差异显著，但总体来说冬季和春季种群结构相似，夏季和秋季相似，这与贺学礼等[25]报道的金银花根际土壤AM真菌多样性的季节性变化研究结果一致。春季和冬季的AM真菌种类比夏季和秋季的AM真菌种类少。这可能是因为AM真菌属于专性共生菌，不能直接获取光合产物，必须依赖寄主植物提供碳水化合物，光照条件影响植物光合作用，从而影响AM真菌群落组成。

通过AM真菌种群在属水平上的分布及相对丰度图可知，蔗田土壤中含量最高的是球囊霉属（Glomus），之后是类球囊霉属（Paraglomus）和多样孢囊霉属（Diversispora），以及少量的原囊霉属（Archaeospora）、巨孢囊霉属（Gigaspora）、无梗囊霉属（Acaulospora）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）和两性球囊霉属（Ambispora）。AM真菌种群中球囊霉属所占的比例随时间的变化都是8月到10月降低，10月到12月升高；而类球囊霉属则表现出相反的趋势：8月到10月升高，10月到12月降低。

本研究中施肥处理在12月时AM真菌的多样性要高于不施肥处理，但在后续分析中发现，12月时施肥处理在属水平上的多样性却低于不施肥处理，而且几乎全部为球囊霉属。造成这一现象的原因可能是施肥降低了AM真菌在属水平上的多样性，但却增加了球囊霉属的多样性。这与高萍等[26]和Jansa等[27]发现施肥会增加球囊霉属的多样性而降低AM真菌的多样性结果一致。

本研究结果表明，甘蔗根际土壤AM真菌丰富度和多样性在夏季和秋季显著高于春季和冬季，并且夏季和秋季的AM真菌种群组成与春季和冬季存在显著差异。研究结果对进一步探讨AM真菌在甘蔗不同生长季节发挥的作用，以及筛选合适的AM真菌进行以菌根为主的甘蔗干旱生态系统的植被恢复具有重要的意义。

4 结论

4个季节共检测到10属AM真菌，AM真菌丰富度、Shannon-Wiener指数和Invsimpson指数从春季到冬季先降后升，夏季最低；4个季节共检测出281个AM真菌OTUs（operational taxonomic units），春季、夏季、秋季、冬季的OTUs数目分别为160、68、103、198个。4个季节甘蔗根际土壤中球囊霉属（Glomus）占有绝对的优势，之后是类球囊霉属（Paraglomus）和多样孢囊霉属（Diversispora）。此外，也有少量的原囊霉属（Archaeospora）、巨孢囊霉属（Gigaspora）、无梗囊霉属（Acaulospora）、盾巨孢囊霉属（Scutellospora）和两性球囊霉属（Ambispora）。

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