抑制尖孢镰刀菌人工肽适体的筛选和鉴定

黄君君　马香　唐鸿倩　刘柱　唐燕琼

摘 要 香蕉枯萎病严重危害香蕉产业的发展。本研究从肽适体文库中筛选获得对香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌有抑制作用的人工肽适体SNP-D4。通过构建人工肽适体体外重组表达载体，获得SNP-D4体外重组蛋白。结果表明，通过抑菌活性检测表达人工肽适体SNP-D4的大肠杆菌全蛋白提取液，能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发，使其萌发率降低至19.60%。本研究筛选得到的人工肽适体SNP-D4可应用于研发环境友好型特异抗真菌生物制剂，为香蕉枯萎病防治提供新的技术手段。

关键词 香蕉枯萎病；肽适体；尖孢镰刀菌；载体构建；抑菌活性

中图分类号 S46 文献标识码 A

Abstract Banana fusarium wilt was a serious disease which causes great damages to banana-developing industries. Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4 was considered as the essential pathogen. In this study， the artificial pepaptamer SNP-D4 was identified from our created pepaptamers library for the inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. cubense FOC4. The recombinant expression vector SNP-D4 was constructed and expressed. The results of antifungal activity test revealed that the total protein extract of Escherichia coli containing SNP-D4 expression could specifically inhibite up to 19.60% of the germination rate for F. oxysporum FOC4. Collectively， our present study implied that the artificial pepaptamer SNP-D4 could be applied to develop environment-friendly biological agents for the control of specific fungal disease， offering a new technique for the prevention and control of banana fusarium wilt.

Key words banana fusarium wilt；pepaptamers；Fusarium oxysporum；vector construction；antifungal activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.022

香蕉枯萎病是一种侵染香蕉植株维管束的真菌引起的土传病。由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC）真菌侵染香蕉根部引起的土传维管束病害[1]，难以根治，对香蕉产业造成了毁灭性危害[2]。其中尖孢镰刀菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，FOC4）的毒力和致病能力都远超其他生理小种[3]，且具有极强的抗逆性，可在土壤中存活20 a之久[4]，会常造成大面积毁园[5]，是威胁我国香蕉产业的主要因素之一。尖孢镰刀菌以菌丝体、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附着于根系表皮细胞[6]，通过分泌一系列毒素破坏根系的膜结构，造成植株代谢紊乱[7]，感染后期可直接侵染植株维管束，导致维管束木质化[8]。目前，对香蕉枯萎病仍缺乏有效的防护措施[9]，相关的防治研究主要集中在化学农药筛选方面，也有部分研究者寻找有效的生物防治手段[10]。

肽适体（peptide aptamer或pepaptamers）是一种筛选自人工合成的随机氨基酸文庫，可高特异性、高亲和力结合靶标蛋白质的短肽[11]。其主要结构包括一段结构稳定的支架蛋白（scaffold protein）和两端固定在支架蛋白上的可变肽段[12]（图1），其中的可变肽段通常由8～20个氨基酸组成，具有识别和结合特异靶蛋白的能力。人工肽适体的筛选和应用是目前生物抗菌剂研发的热点，其具有以下3个方面优势：第一，靶标特异性极高，可以区分同一蛋白家族的不同成员；其二，分子量较抗体小，但对靶蛋白的识别与结合能力与抗体相当；其三，体内可折叠为稳定的三级构象，与一般的游离氨基酸相比更有利于保持较高生物学活性[13]。

目前肽适体在肿瘤治疗[14]、食品安全[15]、植物生物技术[16]等方面中的巨大潜力已被发现[17]。在植物病害防治中的应用主要是作为植物病毒的干扰剂，通过阻断病毒感染周期的特定环节阻碍病毒感染植物[18]。Rudolph等[19]以番茄斑萎病毒的核衣壳为靶标筛选到肽适体，转化烟草Nicotiana benthamiana中，使其同时对番茄斑萎病毒 （TSWV）、番茄退绿叶斑病毒（TCSV）， 花生环斑病毒 （GRSV）， 菊花茎部坏疽病毒（CSNV）等产生抗性。

利用肽适体防治植物真菌病害的研究还有待开拓。本实验室前期以改造的葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal Nuclease，SNase，下文简称SN）为支架蛋白，将可编码16个随机氨基酸的文库DNA插入SNase中，获得系列质粒pTRG-SNase-peptide（简称pTRG-SNP，后文中SNase-peptide均缩写为SNP），构成一个库容量约为1.5～2.0×107 的肽适体文库，同时构建了仅表达肽适体支架蛋白的pTRG-SN质

粒[20]。本研究通过尖孢镰刀菌孢子萌发试验，直接筛选肽适体文库，获得能够特异性抑制尖孢镰刀菌的人工肽适体SNP-D4，通过体外表达SNP-D4并进行抑菌活性检测，证明人工肽适体SNP-D4能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发。本研究的结果为研发抗尖孢镰刀菌的生物抗菌剂提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和病原菌 供试菌株：大肠杆菌reporter，大肠杆菌BL21（DE3）。病原菌：尖孢镰刀菌热带四号小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，FOC4）。以上菌株均由本实验室保存。

1.1.2 培养基 LB液体培养基：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL， pH 7.0，121 ℃灭菌20 min； LB固体培养基：在LB液体培养基基础上添加琼脂糖1.5 g即成，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min；0.3%营养液：葡萄糖0.3 g，酵母提取物0.3 g，胰蛋白胨0.03 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 肽适体文库的筛选 将肽适体文库转入制备好的大肠杆菌reporter感受态细胞中，分离单菌落并使用特异性引物F1和R1验证，之后分别保存菌种。将保存的菌株分别接种至5 mL含四环素（Tet，终浓度50 μg/mL）的LB液体培养基中，37 ℃，150 r/min摇床过夜；按1%接种量将菌液接种至20 mL的LB液体培养基（含Tet，终浓度50 μg/mL）中，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，简称IPTG，终浓度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min诱导过夜。收集菌体，用4 mL 50 mmol/L磷酸缓冲溶液（Phosphate Buffered Saline，简称PBS）悬浮，进行超声破碎。超声5 s，间隙6 s，功率35%，共20 min。收集上清，即细菌全蛋白提取液。将10 μL转入pTRG-SNP载体的reporter菌株细菌全蛋白提取液、10 μL 4×106个/mL尖孢镰刀菌孢子悬液、10 μL 0.3%营养液混匀，同时以PBS处理作为空白对照，转入pTRG-SN载体的reporter菌株的细菌全蛋白提取液作为阴性对照，0.3%恶霉灵处理作为阳性对照，不同处理组均在28 ℃培养箱培养12 h后于光学显微镜40×物镜下观察孢子萌发情况。

1.2.2 功能性肽适体的鉴定 将筛选到的菌株划线活化，37 ℃培养过夜。每种菌株挑选3个单菌落，再次划线活化，37 ℃培养过夜；挑单菌落于5 mL LB液体培养基（含Tet，终浓度50 μg/mL）中，37 ℃ 250 r/min培养过夜；提取质粒并测序。

1.2.3 重组载体构建 利用目的片段特异性引物F2/R2扩增肽适体SNP-D4以及肽适体支架蛋白SN核苷酸序列，利用PCR产物回收试剂盒回收目的片段。将上述目的片段及pET28a空载体分别用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，之后回收酶切产物。将上述酶切产物用T4连接酶连接，得到连接产物。

1.2.4 重组质粒转化和阳性克隆子鉴定 将连接产物通过热激法转入大肠杆菌BL21感受态细胞，之后涂布到含卡那霉素（Kan，终浓度50 μg/mL）的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。之后挑取阳性克隆子，分别使用载体特异性引物F2/R2和目的片段特异性引物F3/R3进行PCR验证。最后将经验证的阳性克隆提取质粒并测序。

1.2.5 重组蛋白的表达 将构建重组载体阳性克隆接种至5 mL LB液体培养基（含Kan，终浓度50 μg/mL），37 ℃，150 r/min摇床过夜；将活化的菌液按1%接种量接种至50 mL的LB液体培养基（含Kan，终浓度50 μg/mL）中；加入IPTG （终浓度100 μmol/L），15 ℃，150 r/min诱导过夜。

1.2.6 抑菌試验 通过上述方法诱导重组菌株大量表达外源蛋白SN和SNP-D4之后，之后采用超声波破碎获得细菌全蛋白提取液，采用BCA法（使用GENEray公司的BCA法蛋白定量试剂盒）测定全蛋白浓度。将细菌全蛋白提取液蛋白浓度均稀释至30 mg/mL，将10 μL细菌全蛋白提取液、10 μL 4×106个/mL尖孢镰刀菌孢子悬液、10 μL 0.3%营养液混匀，同时以PBS处理组为空白对照，3组处理均在28 ℃培养箱培养12 h后，在光学显微镜40×物镜下观察孢子萌发情况，每组取3个不同的视野，观察并统计萌发率。萌发率=萌发孢子数/总孢子数×100%。重复3次取平均值。

1.3 数据分析

试验所得数据采用SAS 9.0统计学分析软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 肽适体文库筛选

从肽适体文库中分离鉴定得到32个肽适体单克隆。初步抑菌实验结果显示，在32个肽适体单克隆中，发现5种肽适体对尖孢镰刀菌孢子具有抑制作用，其中SNP-D4效果最佳。从图2中可看出，在相同处理时间下，PBS处理组与转入pTRG-SN载体的reporter菌株的细菌全蛋白提取液处理组的孢子几乎全部萌发，形成明显的菌丝体，出现菌丝结团现象，说明PBS与转入pTRG-SN载体的reporter菌株的细菌全蛋白提取液对孢子的萌发不具抑制作用，而SNP-D4处理组的孢子大多数未萌发，少数萌发的孢子的菌丝长度明显短于阴性对照组，并未出现菌丝结团现象，其抑制效果几乎与0.3%恶霉灵处理组相当，说明SNP-D4本身对孢子的萌发具有一定抑制作用。

红色圆圈标记的为未萌发的孢子，红色箭头标记的为萌发受到抑制的孢子。

为了确定具有孢子萌发抑制活性的SNP-D4的序列信息，提取表达SNP-D4的质粒并测序，得到SNP-D4全长576 bp，编码191个氨基酸，整体蛋白分子量大小为21 ku（图3）。其编码的可变肽段序列为共16个氨基酸（图3中红色边框标记的部分）。

2.2 人工肽适体SNP-D4原核表达载体构建

通过菌落PCR验证阳性转化子扩增结果如图4所示，表达SN的候选菌落使用2种引物扩增分别获得724、537 bp的单一条带，表达SNP-D4的候选菌落使用2种引物扩增分别获得769、582 bp的单一条带，而且PCR产物单一，无其他杂带或污染，符合预期。提取重组质粒并测序，将测序结果与SN和SNP-D4的核酸序列进行比对，序列一致，表明已经成功构建可外源表达SN和SNP-D4的重组载体。

2.3 外源表达人工肽适体SNP-D4抑菌效果评估

通过抑菌实验验证外源表达人工肽适体SNP-D4的抑菌效果，孢子萌发率统计结果见图5。从图5可见，用表达人工肽适体SNP-D4的细菌全蛋白提取液处理时，尖孢镰刀菌孢子萌发率仅为19.60%，与之相比，用PBS处理时的萌发率为78.33%，二者之间差异极显著（p<0.01），用肽适体支架蛋白SN的细菌全蛋白提取液处理时，孢子萌发率为72.10%，与空白对照PBS并未有显著差异，表明本研究所筛选的人工肽适体SNP-D4能够特异性抑制尖孢镰刀菌的孢子萌发。另外肽适体支架蛋白SN对尖孢镰刀菌的孢子萌发没有显著影响，说明发挥抑菌功能的是肽适体SNP-D4的可变肽段部分。

3 讨论

香蕉枯萎病是香蕉产业的重要真菌病害之一，长期以来都引起人们的高度重视。目前可以用于防治香蕉枯萎病的化学药剂包括恶霉灵、多菌灵[21]等。Borges 等[22]在枯萎病菌侵染前用甲萘醌亚硫酸氢钠（一种维生素K）处理香蕉苗，发现处理后的香蕉苗中，植物抗毒素快速且大量合成，能够延缓枯萎病症状的发生。但是，化学药剂有效成分难以分离和鉴定，而且通常价格昂贵，并且化学药剂的大量使用存在污染环境等问题。生物防治方面的研究主要包括筛选拮抗菌[23]、农作物间作及轮作[24]等，其中拮抗菌是一种非常重要的防治手段。李载渊等[25]通过生长对峙实验从五指山原始林区采集的土样中选择性分离得到702 株稀有放线菌，最终经过复筛，获得一株对尖孢镰刀菌具有高活性的拮抗菌210-1-61。但是，拮抗菌也存在抑菌机理不清楚，以及破坏土壤微生物生态平衡等问题。因此，为了有效防止尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病，仍需要探索新型、环保的有效技术手段。

肽适体作为一种新型生物材料，被广泛应用于药物研发方面，而其在生物农药方面主要是用作抗病毒制剂[26]。针对特定的生理功能分析，如病毒DNA复制复合体组装等[27]，是通过筛选特定病毒靶标具有高特异性的肽适体，达到干扰病毒功能的作用。本研究首次尝试将肽适体应用于抑制尖孢镰刀菌，成功筛选到能够特异性抑制香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌的肽适体，并获得其外源表达蛋白。研究发现，含有外源表达人工肽适体SNP-D4的细菌全蛋白提取液可将FOC4的孢子萌发率降低至19.60%，而人工肽适体的支架蛋白并未对孢子萌发率有显著影响（处理后萌发率为72.10%），说明发挥抑菌功能的为人工肽適体SNP-D4可变肽段部分的16个氨基酸。综上所述，人工肽适体SNP-D4能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子萌发，具有作为一种新型生物农药的潜力。

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