连作茶树根际土壤自毒潜力、酶活性及微生物群落功能多样性分析

王海斌 陈晓婷 丁力 邱丰艳 孔祥海 叶江华 贾小丽

摘 要 为了分析茶树连续种植后对茶树根际土壤生理及微生物功能多样性的影响，本研究以植茶年限4、9、30 a的铁观音茶树根际土壤为材料，探讨植茶年限与土壤自毒潜力、土壤酶和土壤微生物功能多样性关系。结果表明：随着植茶年限的增长，茶树根际土壤对受体莴苣、白菜、萝卜根长的抑制率呈现显著性上升。土壤过氧化氢酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶活性随着植茶年限的增长呈下降趋势，而多酚氧化酶及纤维素酶的活性呈上升趋势。BIOLOG ECO生态板法结果表明，随着植茶年限的增长，土壤微生物对羧酸类、酚酸类、脂肪酸类及氨基酸和胺类碳源的利用率呈显著增长，糖类碳源无显著差异。主成分分析结果表明，贡献率为44.29%的主成分1是羧酸类、酚酸类和脂肪酸类物质，贡献率为13.47%的主成分3是含氮物质，而贡献率为42.24%的主成分2是糖类碳源。上述结果表明，隨着植茶年限的增长，土壤中酸类物质不断积累促使酸化程度加重，与抗氧化和营养循环相关的土壤酶活性降低，导致土壤养分循环能力下降，好酸性微生物的数量增加，土壤微生物种群结构与功能单一化，土壤自毒潜力不断加剧，不利于茶树生长。

关键词 茶树根际土壤；自毒作用；土壤酶活性；微生物功能多样性

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Abstract To analyze effect of rhizosphere soil environment of tea tree to diversity of functional microbes， soils of 4-， 9- and 30-planted years in Tieguanyin plantation were used as materials， and effects of planting age on soil autotoxicity， enzyme and divercity of functional microbes were explored. The result showed that rhizosphere soil inhibited root length of the lettuce（Lactuca sativa L.）， cabbage（Brassica bara L.） and radish（Raphanus sativus L.） significantly with increased number of planted years. Activities of catalase， phosphatase， protease， sucrose enzyme， urease decreased significantly with increase in planted years， and activities of polyphenol oxidase and cellulose presented an opposite trend. The MDA levels increased significantly with increase of soil planted years. BIOLOG ECO ecological plate method results showed that soil microbes to carboxylic acids， phenolic acids， fatty acids， amino acid and amine carbon source utilization increased significantly with the increase of planting age， and sugar carbon source had no significant difference. Principal component analysis results showed that contribution rates of the principal component 1 （carboxylic acids， phenolic acids and fatty acid）， the principal component 2（sugar carbon source） and the principal component 3（nitrogenous substances） reached 44.29%， 42.24% and 13.47%， respectively. These results showed that accumulation of acid chemicals led to soil acidification aggravating with the increase of planting age， and soil enzyme activity related to antioxidant and nutrient cycling declined， and so soil nutrient cycle suffocated. Furthermore， the number of good acid microbes increased， and soil microbial community structure and function simplified. In final， tea tree growth suffocated due to soil autotoxicity.

Key words rhizosphere soil of tea tree； autotoxicity； activity of soil enzymes； microbial functional diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.004

茶树是中国重要的经济作物之一，茶树的生命周期可达百年以上，然而茶树投产后的经济寿命却不足20 a[1]。据国家统计局统计分析，2016年中国茶园面积287万hm2，茶叶总产量242万t，居世界首位，然而茶叶单位面积产量却低于世界平均水平，且有下降趋势。Zheng等[2]研究表明茶叶连年采收、修剪、肥力供应的不足和茶树土壤生态平衡的失调是导致茶叶产量下降及低产茶园形成的原因。众多学者尝试运用不同的方法对低产茶园进行改造，但收效甚微[3-4]。

茶叶品质的下降与茶树连作障碍的形成有关。据报道，茶树连作障碍形成的原因主要为：茶树自身根系分泌物及其互斥反应、土壤营养成分失衡、土壤酸碱度异常、线虫数量及土壤病原物的增多[2，5]。众所周知，植物生长过程中体内物质对外的释放途径，除了挥发性物质，其余均需经载体土壤传播，进而对其他植物产生影响[6-8]。茶树物质的释放主要通过根系进行，根际的区域有限，一般指贴近根表或根轴的区域。根际存在的化学条件和进行的生物化学过程不同于本体土壤。其中最明显的就是根际pH值、氧化还原电位和微生物活性的变化等，在根际土壤溶液中养分浓度的分布与本体土壤有明显差异[9-12]。因此，根系与土壤连接的区域便形成了一种独特的根际生态系统。在这一系统中微生物在茶树物质的影响下发生着显著变化，如土壤微生物活动、种群分布、多样性及酶活性等[13-14]。伍丽等[15]探讨茶树根际土壤因子对根际微生物数量影响，结果发现茶树主要通过改变土壤pH值、速效磷及其它因子来改变土壤真菌及细菌的数量；林生等[16-17]探讨不同年限茶树土壤微生物的功能多样性，结果发现随着茶树树龄的增加，茶树根际土壤的pH值呈下降趋势，运用末端限制性片段长度多样性（T-RFLP）技术分析根际土壤微生物多样性时发现，不同年限茶树根际土壤的微生物种群多样性存在着显著的差异。孙海新等[13]研究发现，茶树种植土壤的肥力对土壤真菌数量的变化具有显著的相关性；茶树连作对土壤微生物的研究众多，然而大量学者在于探讨茶树根际微生物群落结构的改善与变化，对于茶树连作土壤的酶活性及微生物功能性变化的研究较少。因此，本研究以连作4、9、30 a的土壤为材料，以未种植茶树的土壤为对照，分析连作茶树土壤的酶活性及微生物功能多样性的变化，以期为茶园改造、茶树连作障碍的消减提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以铁观音原产地福建省泉州市安溪县为研究地点，收集已种植4、9、30 a的铁观音茶树根际土壤，以未种植茶树的土壤为对照，用于土壤自毒潜力评价、土壤酶活性测定及微生物功能多样性的Biolog分析。取样地位于东经117°93′、北纬24°97′，海拔在650～800 m范围，年降雨量1 800 mm，相对湿度80%左右，年平均气温16～18 ℃。取样地茶园总面积134 hm2，其中4 a茶树种植面积约为23 hm2，9 a茶树种植面积为26 hm2，30 a茶树种植面积为0.6 hm2。茶树根际土壤取样参考Fujii等[18]的5点取样法。选择合适的茶树，去除表层落叶，轻挖茶树，除去茶树周边附着土壤，抖落离茶树根系1 cm的土壤即为根际土壤。每个样品收集5株茶树根际土壤混合，收集样品量300 g。以茶园内未种植茶树的荒地土壤为空白对照土壤，按照上述取样法，去除地表植被和凋落物后，收集15～25 cm范围的土壤，3个重复样点，收集样品量300 g。茶园土壤的基本理化指标为，有机质含量10.45 g/kg、全氮含量2.63 g/kg、全磷含量1.37 g/kg、全钾含量1.72 g/kg、速效氮含量27.2 mg/kg、速效磷含量79.3 mg/kg、速效钾含量305.2 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 土壤对受体的影响 土壤对受体的影响采用土壤-琼脂三明治法进行测定，并略做修改[19]。称取土壤15 g样品，加入冷却至约45 ℃左右的浓度为0.8%的琼脂溶液30 mL，充分混匀，待固化后再加2 mL浓度为0.5%的琼脂溶液复盖表面，冷却后每个培养皿中分别播入10粒预萌发的莴苣、白菜、萝卜，以空白土壤处理为对照，6次重复，置于人工气候箱中。莴苣培养温度为25 ℃，白菜、萝卜的培养温度为30 ℃，每天光照12 h（7：00～19：00）。莴苣培养3 d后测定根长，白菜、萝卜培养5 d后测定其根长。不同土壤对受体的影响采用相对抑制率（Inhibition rate，IR）来评价，计算公式为：IR=（1-处理值/对照值）×100%。

1.2.2 土壤酶活性测定 依据关松荫[20]的方法测定土壤酶活性；过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法；多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法；脲酶活性的测定采用比色法；蛋白酶活性的测定采用Folin-Ciocslteu法；磷酸酶活性的测定采用对硝基苯磷酸盐法；蔗糖酶活性的测定采用硝基水杨酸法；纤维素酶活性的测定采用蒽酮比色法。

1.2.3 土壤微生物功能多样性测定 采用BIOLOG ECO微平板法[21]测定不同土壤的微生物功能多样性。上样前将BIOLOG ECO平板预热到25 ℃，用移液器取150 μL提取液于各孔中，28 ℃避光隔水恒温培养，在0、1、2、3、4、5、6、7 d用ELISA反应平板读数器读取平板中各反应孔在590 nm处的吸光值。采用BIOLOG ECO平板中每孔颜色平均变化率（average well color development，AWCD）表示土壤微生物群落ELISA反应的结果。AWCD=[∑（Ci-R）]/N，其中Ci是所测定的31个碳源孔的吸光值，R为对照孔的吸光值，N为碳源的数目。

1.3 数据处理与分析

数据分析过程中的方差显著性分析及相关性分析、主成分分析均使用DPS软件。

2 結果与分析

2.1 不同种植年限茶树根际土壤对受体的影响

不同年限茶树土壤对受体的影响结果见表1，随着茶树种植年限的增加，茶树根际土壤对受体莴苣、白菜、萝卜的影响加剧，与对照相比，表现为受体根长随植茶年限的延长而下降，即受体根长抑制率呈上升的趋势，且不同年限之间存在显著性差异。

2.2 不同种植年限茶树根际土壤酶活性分析

土壤酶活性分析结果见表2，对照土壤的多酚氧化酶、过氧化氢酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活性分别为0.34、2.61、0.46、2.51、14.38、2.49、1.97 mg/g；与对照土壤相比，随着土壤年限的增加（4、9、30 a），过氧化氢酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶的活性均呈下降趋势，而多酚氧化酶、纤维素酶活性则呈上升趋势。

相关性分析结果见表3，根际土壤对受体莴苣的抑制率与根际土壤的过氧化氢酶活性、磷酸酶活性、蛋白酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性呈显著或极显著负相关，而与多酚氧化酶活性、纤维素酶活性呈显著正相关；除脲酶以外，根际土壤对受体白菜和萝卜的抑制率与其它酶活性的相关性均未达到显著水平。

2.3 不同种植年限茶树根际土壤微生物碳源利用率与主成分分析

以第7天测定的不同土壤微生物对碳源利用率的AWCD值进行分析，结果见图1，随着植茶年限的增加，茶树根际土壤微生物对羧酸类、酚酸类、脂肪酸类、氨基酸和胺类碳源利用率的AWCD值呈现上升趋势，而对糖类无显著差异，且羧酸类碳源的利用率在0、4 a土壤中不存在显著差异，0、4 a土壤与9、30 a土壤存在显著差异。可见，不同年限土壤微生物对碳源利用程度存在明显的区别。

进一步分析不同年限茶树土壤微生物对碳源利用率的主成分，结果见图2，不同年限土壤微生物对31种碳源的利用率划分成3大成分，即主成分1、主成分2、主成分3，贡献率分别为44.29%、42.24%、13.47%。此外，由图2可看出，3大主成分分别将4种不同样品划分在不同的区域，可见，31种碳源划分的3大成分能够有效区分4种不同的样品。

2.4 不同碳源与主成分的相关性分析

由表4可見，与主成分1相关的碳源有9种，分别是酚酸类（2-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸）、羧酸类（吐温40、吐温80、丙酮酸甲酯）和脂肪酸类（D-苹果酸、α-丁酮酸、γ-羟基丁酸、甲叉丁二酸）；与主成分2相关的碳源主要是6种糖类；与主成分3相关的碳源有3种，主要是含氮的氨基酸（L-天冬酰胺）和胺类（苯乙胺、腐胺）。可见，3大主成分有效区分4种不同的土壤样品，而在区分4种不同土壤样品的过程中，主成分1中起主要贡献作用的是酚酸类、羧酸类、脂肪酸类碳源，主成分2中起主要贡献作用的是糖类碳源，主成分3起主要贡献作用的是含氮的氨基酸和胺类碳源。

3 讨论

植物在生长及衰退过程中都会向土壤释放大量的次生代谢物，同一植物在连续种植后，其向土壤环境释放的次生代谢物不断积累，当达到某一浓度时即可与同类植物产生互作毒害作用[5]。本研究以不同年限茶树根际土壤为材料进行生物测试，结果表明茶树根际土壤对受体莴苣、白菜、萝卜根长的抑制作用随着植茶年限的增加而增大。Wu等[22]研究发现地黄连作后，连作土壤对受体的影响随着土壤连作年限的增加而增大。陈冬梅等[23]研究烟草连作后，土壤的化感自毒潜力也同样得到类似的结果。可见，随着茶树植茶年限的增加，茶树根际土壤的自毒潜力呈上升趋势。

本研究进一步探讨茶树根际土壤酶活性的变化，结果表明，大部分土壤酶活性随着植茶年限的延长呈下降趋势，而多酚氧化酶及纤维素酶活性呈上升趋势。过氧化氢酶主要与土壤抗氧化性相关[24]，可见植茶年限的延长使得土壤的抗氧化能力下降。营养元素是茶树生长的基础，土壤中的磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、脲酶活性与土壤中的P、N、C等的循环呈正相关[25]。植茶年限的延长使得磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶、尿酶活性呈下降趋势，造成土壤中养分的循环能力下降，土壤营养元素缺乏，导致茶树生长受阻。多酚氧化酶与土壤抗性及土壤内部酚类物质的氧化有关，而纤维素酶与纤维素的降解有关[26]。植茶年限的延长，土壤中残留的茶树枯枝落叶较多，而茶树叶片本身含有大量的多酚聚合体和生物碱，在纤维素酶作用下会降解释放出酚酸类物质，为多酚氧化酶的活性增强提供了基础材料，而酚类物质氧化后可能转变为自毒能力较强的物质醌、酚酸或其他物质还有待于研究。相关性分析也表明了根际土壤对受体的抑制率与土壤酶活性有关联。

土壤微生物对碳源的利用率和主成分物质分析结果表明，贡献率为42.24%的主成分2主要是糖类物质，在3个年份的样品间没有差异。而贡献率为44.29%的主成分1和13.47%的主成分3，主要是酸类物质和含氮类物质，在3个年份的样品间随植茶年限增长而利用率增大，表明随着植茶年限的增长，茶园土壤中酸类物质不断积累，造成土壤日趋酸化，不利于茶树生长。杨宇虹等[19]研究发现连作烟草根系土壤微生物功能发生变化，连作烟草年限的增加使得土壤的酸类物质含量增加。林生等[16-17]研究发现，随着茶树连作年限的增加，茶树根际土壤的酸化程度加重，土壤微生物功能多样性发生变化，主要变化趋势是好酸性微生物的数量增加。茶园属于单一性植物人工生态系统，茶树连续种植模式改变了土壤原有的生态平衡系统，使土壤中酸类物质不断积累，好酸性微生物的大量繁殖，土壤微生物种群结构与功能单一化，土壤自毒潜力不断加剧，不利于茶树生长。土壤自毒作用的消减方法有植物残株清理、土壤改良、有益微生物引入及自毒物质清除等报道[11-12]，进一步探明“物质-微生物-自毒作用”之间的互作机制，将为茶园土壤改良方式提供科学依据。

参考文献

[1] 余继忠，徐家明，黄海涛，等. 重修剪、台刈和改植换种三种茶园改造方式的比较[J]. 茶叶科学，2008，28（3）：221-227.

[2] Zhang Z C，He X L，Li T X. Status and evaluation of the soil nutrients in tea plantation[J]. Procedia Environmental Sciences，2012，12：45-51

[3] 陈秋金. 不同调理剂对茶园土壤理化性状及茶叶产量、品质的影响[J]. 福建农业学报，2014，29（10）：1 015-1 020.

[4] 程博一，韩艳娜，李叶云，等. 施肥模式对茶叶品质、产量构成及土壤肥力的影响[J]. 中国生态农业学报，2014，22（5）：525-533.

[5] Li W，Zheng Z C，Li T X，et al. Effect of tea plantation age on the distribution of soil organic carbon fraction within water-stable aggregates in the hilly region of western Sichuang，China[J]. Catena，2015，133：198-205

[6] Paterson E，Giebbing T，Abel C，et al. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil[J]. New Phytologist，2007，173：600-610

[7] Nakamura L K. Lactobacillus amylovorus，a new starch-hydrolyzing species from cattle waste-corn fermentations[J]. Int J Syst Bacteriol，1981，31：56-63

[8] Hans L，Timothy D，Colmer. Root physiology：from gene to function[M]. Spring Press，2005

[9] Eisenhauer N，Scheu S，Jousset A. Bacterial diversity stabilizes community productivity[J]. PLoS ONE，2012，7：e34517

[10] 吳林坤，林向民，林文雄. 根系分泌物介导下植物-土壤-微生物互作关系研究进展与展望[J]. 植物生态学报，2014，38（3）：298-310.

[11] Singh H P，Batish D R，Kohli R K. Autotoxicity：concept，organisms，and ecological significance[J]. Critical Reviews Plant Science，1999，18（6）：757-772.

[12] Huang L F，Song L X，Xia X J，et al. Plant-soil feedbacks and soil sickness：from mechanisms to application in agriculture[J]. Journal Chemical Ecology，2013，39：232-242.

[13] 孙海新，刘训理. 茶树根际微生物研究[J]. 生态学报，2004，24（7）：1 353-1 357.

[14] 郑雪芳，刘海波，刘 波，等. 不同海拔茶树根系土壤微生物群落多样性分析[J]. 中国生态农业学报，2010，18（4）：866-871.

[15] 伍 丽，余有本，周天山，等. 茶树根际土壤因子对根际微生物数量的影响[J]. 西北农业学报，2011，20（4）：159-163.

[16] 林 生，庄家强，陈 婷，等. 福建安溪不同年限茶树土壤养分与微生物Biolog功能多样性的分析[J]. 中国生态农业学报，2012，20（11）：1 471-1 477.

[17] 林 生，庄家强，陈 婷，等. 不同年限茶树根际土壤微生物群落PLFA生物标记多样性分析[J]. 生态学杂志，2013，32（1）：64-71.

[18] Fujii Y，Akihiro F，Syuntaro H. Rhizosphere soil method：a new bioassay to evaluate allelopathy in the field[C]. Proceedings of the fourth world congress on allelopathy，2004：490-492

[19] 杨宇虹，陈冬梅，晋 艳，等. 不同肥料种类对连作烟草根际土壤微生物功能多样性的影响[J]. 作物学报，2011，37（1）：105-111.

[20] 关松荫. 土壤酶及其研究法[M]. 北京：农业出版社，1986.

[21] 林瑞余，戎 红，周军建，等. 苗期化感水稻对根际土壤微生物群落及其功能多样性的影响[J]. 生态学报，2007，27（9）：644-3654.

[22] Wu L K，Wang H B，Zhang Z X，et al. Comparative metaproteomic analysis on consecutively rehmannia glutinosa–monocultured rhizosphere soil[J]. PLoS ONE，2011，6：e20611.

[23] 陈冬梅，杨宇虹，晋 艳，等. 连作烤烟根际土壤自毒物质成分分析[J]. 草业科学，2011，28（10）：1 766-1 769.

[24] 李思未，罗桂花，乔 枫，等. 白叶枯病菌PX099对CBB23抗氧化酶活性和防御基因表达的影响[J]. 应用与环境生物学学报，2013，19（6）：980-985.

[25] 樊 军，郝明德. 黄土高原旱地轮作与施肥长期定位试验研究Ⅱ.土壤酶活性与土壤肥力[J]. 植物营养与肥料学报，2003，9（2）：146-150.

[26] 杨敬天，苏智先，胡进耀，等. 珙桐林土壤有机质与酶活性的通径分析[J]. 应用与环境生物学学报，2010，16（2）：164-167.