传统海洋中药淡菜高效液相（HPLC）指纹图谱研究

龚曾豪 于春光 金艳霞 王燕 王斌

[摘要]指纹图谱技术在传统中药材及其制剂的质量控制中应用较多，在种类鉴别和质量优劣判断方面具有重要作用。但是，指纹图谱技术在传统海洋中药领域应用较少。基于此，采用高效液相色谱法（HPLC），建立淡菜的HPLC指纹图谱，并根据峰面积和保留时间标定了其中的13个共有峰。利用来自全国不同产区的24批供试品样本验证建立淡菜HPLC指纹图谱的有效性，试验结果证明利用10批供试品所建的HPLC指纹图谱可以快速地区分不同种类的淡菜，联合聚类分析，可对淡菜溯源提供技术支持。因此，淡菜高效液相（HPLC）指纹图谱可为其物种鉴别和溯源提供技术支持，对其有效成分的分离和鉴别提供了科学依据，也为其他传统海洋中药的质量控制提供借鉴。

[关键词]指纹图谱；淡菜；高效液相色谱；聚类分析

[中图分类号]R284 [文献标识码]A

传统中药材的产地来源与其品质和质量安全息息相关，建立健全的中药材质量评价和溯源体系对保证中药材质量安全至关重要。我国中药材的质量控制分为两个方面，依靠定性鉴别（性状鉴别和显微鉴别技术）确定样品的真伪，该方法需要鉴定者长期工作于第一线接触实物，具备较强的实践经验；而以化学物质基础及其性质的理化鉴别评价中药材的优劣，重点监测药材复杂成分中的少数特定的“有效成分”，但是因为检测的对象少，容易忽视不同化学成分之间的协同作用。目前，以化学成分为基础的指纹图谱技术广受关注，被确认为传统中药材品种鉴定、质量控制和产地溯源的关键技术，而以指纹图谱作为控制传统中药材品質的方法得到国际社会认可。目前，色谱技术（如高效液相色谱（HPLC）和波层色谱）、光谱技术（如红外光谱和核磁共振）逐渐多样化，且应用日益普遍，且各种仪器的性能和精密度和检测能力日益增强，为指纹图谱研究和应用奠定了良好基础。高效液相（HPLC）指纹图谱法不但可用特征峰做定性鉴别，还可以根据各峰的相对峰面积进行定量分析，是目前中药化学成分指纹图谱的主流方法。

淡菜为贻贝科动物肉的干制品，具有补肝肾，消瘿瘤，益精血之功效，袁高峰等试验证明其脂溶性成分具有较好的抗炎效果。我国从南至北各海域均产有贻贝，是世界上贻贝产量最高的国家，品种主要有翡翠贻贝（Perna viridis）、紫贻贝（Mytilus edulis）和厚壳贻贝（Mytilus coruscus），但是产地和品种不同致使贻贝质量参差不齐，加工成淡菜后品质不一。所以，利用指纹图谱技术建立淡菜的质量评价和产地溯源技术对其产业发展意义重大。基于此，本实验以国内不同区域的24批淡菜供试品为研究对象，利用高效液相色谱（HPLC）技术建立淡菜HPLC指纹图谱，并结合聚类分析鉴别淡菜的产地。

1 实验材料与方法

1.1 实验试剂与材料

色谱纯乙腈和甲醇分别购于美国Fisher公司和Burdick & Jackson公司；无水乙醇、甲醇均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司，24批传统药食两用海洋中药淡菜供试品分别购于全国主要的贻贝产地，详细信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备。参照孟志娟试验方法，以无水乙醇为提取溶剂采用超声提取法制备淡菜醇提物。具体操作流程如下：淡菜干燥、粉碎过40目筛，按照1 g/100 mL比例称取0.7 g加入到盛有无水乙醇的圆底烧瓶中，密塞并称重，用超声波提取器在300 W功率下超声提取30 min后，补足损失无水乙醇，利用旋转蒸发仪去除提取物中的乙醇，然后加入色谱纯甲醇，利用超声溶解提取物，最后定容至5mL，微孔滤膜（0.45?m）除去溶液中的不溶性杂质，得供试品溶液。

1.2.2 HPLC实验条件。色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18 （4.6 × 250 mm， 5μm）；检测波长：210 nm；参比波长：360 nm；Agilent柱温箱G1316A温度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；供试品自动进样器G1313A进样量：20 ?L；流动相：色谱纯乙腈（A）-0.1%色谱纯磷酸水（B）梯度洗脱，梯度程序如表2所示。

2 结果

2.1 海洋中药淡菜参考指纹图谱的建立

根据1.2.1的方法制备S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供试品的溶液，按照试验方法1.2.2所描述的HPLC色谱条件分别将10批淡菜供试品的溶液加入到HPLC中，获得相关色谱数据，以AIA格式将所得到的供试品HPLC图谱数据（保留时间和峰面积等）依次导入国家药典委员会推荐的数据处理软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），对相关数据进行比对和分析，以淡菜供试品S1（大连夏方水产有限公司）的HPLC色谱图为参照谱图进行指纹匹配，建立S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供试品的对照指纹图谱共有模式，结果如图1中的R色谱图所示。根据对照指纹图谱共有模式中各个色谱峰的峰面积及稳定性，确定其中的13个峰为共有峰（见图2），共有峰面积之和占总峰面积的90%以上，符合高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的标准。

基于峰面积和相对保留时间的相似度分析是建立传统中药材供试参考指纹图谱的主要途径，也是样品间比较分析的报告重要依据。因此，本实验根据10批淡菜供试品（S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11、S12）的HPLC图谱的峰面积和相对保留时间信息，利用国家药典委员会推荐的数据处理软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），计算与对照指纹图谱的相似度，结果如由表3所示。供试品S2的HPLC图谱与对照指纹图谱的相似度最高，而供试品S6的HPLC图谱与对照指纹图谱的相似度最低。因此，确定供试品S2的图谱作为淡菜的HPLC参考指纹图谱（见图2）。

2.2 高效液相色谱（HPLC）特征峰的确定及淡菜供试品真伪鉴别

特征峰是代表检测样品特征属性的化学成分在色谱图上的体现，具有特定保留时间，并且与其他化学成分的峰面积具有相对固定的比值。由图1和图2相关信息表明，色谱峰P4、P6、P8、P9和P10的分离度比较好，特征明显，可以代表本实验所检测的淡菜样品的指纹特征。因此，选择5个主要共有峰（P4、P6、P8、P9和P10）为淡菜指纹图谱的特征峰。其中特征峰P6的峰面积较大，与其他色谱峰比较具有明显优势，而且其出峰时间处于高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的中间，易于和其它峰进行比较分析，确定其为色谱图的参照峰。

利用HPLC建立的中药材的指纹图谱，特别是其中的特征信息（特征峰的相对保留时间参数）可以专一的体现所检测中药材的特性。因此，利用指纹图谱进行中药材的真伪和优劣鉴别是其建立的重要目的。因此，将淡菜高效液相色谱（HPLC）参考指纹图谱参照峰（P6号峰）的相对保留时间（RRT）定为1，计算试验所检测的10批淡菜供试品指纹图谱剩余4个特征峰的相对保留时间（RRT），结果见表4。取剩余未进行分析的14批淡菜供试品进行分析，其色谱图见图3。与图2比较分析表明：淡菜高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的5个特征峰均存在于剩余的采集于全国主要产区的14批淡菜供试品；与前10批样品的特征峰的相对保留时间（RRT）平均值进行比较，结果表明剩余的采集于全国主要产区的14批淡菜供试品各特征峰相对保留时间（RRT）与之吻合度良好，证明剩余的采集于全国主要产区的14批供试品均非伪品。

2.3 淡菜供试品的产地鉴别

以淡菜供试品指纹图谱中6号峰为参照峰，相对峰面积定为1，计算24批淡菜供试品指纹图谱13个共有峰的相对峰面积，并以13个共有峰的相对峰面积为指标，将24批不同产地的淡菜供试品的共有峰相对峰面积导入SPSS19.0进行聚类分析，结果见图4。

图4中横坐标代表采集于全国主要产区的24批淡菜供试品之间的距离，纵坐标代表全国主要产区的24批淡菜供试品的编号。由图4可知，除供试品S7（烟台龙润食品有限公司）、S10（青岛福兴祥物流股份有限公司）、S21（烟台、散装）外，相同产地的淡菜供试品均聚集为相同的类群。该研究结果也表明产地不同导致淡菜供试品在化学组成上存在一定差异，而HPLC指纹图谱辅以聚类分析能较好地反映出供试品与产地之间的关系。

3 結论

本文以10批传统药食两用海洋中药淡菜为供试品，建立淡菜的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，指纹图谱中包含了13个共有峰。应用国家药典委员会推荐的数据处理软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行相似度计算，结果表明10批传统药食两用海洋中药淡菜样本指纹图谱具有良好的相似度，达到了建立中药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱要求。在此基础上，对24批供试品进行了聚类分析（clustering analysis），结果表明采集于全国主要产区的24批淡菜供试品基本能根据样品来源聚集成同一类群。因此，HPLC指纹图谱能够较好的对淡菜进行品种和产地鉴别，为海洋中药质量标准的建立及溯源技术研究提供了技术支持。

[参考文献]

[1] 马冬红，王锡昌，刘利平.近红外光谱技术在食品产地溯源中的研究进展[J]. 光谱学与光谱分析，2011，31（4）：877-881.

[2] 王燕，王斌，徐焕志，等.基于聚类分析和主成分分析法的淡菜醇提物红外指纹图谱[J].水产学报， 2012，36（7）：1146-1152.

[3] 吴伟建，王燕，王斌，等.基于聚类、主成分和判别分析的海龙乙醇提取物红外指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2013，48（8）：1540-1544.

[4] 王斌，任西杰，王燕，等.基于聚类、主成分和判别分析的海马乙醇提取物红外指纹图谱研究[J].中国药学杂志， 2013，48（4）： 253-258.

[5] 王燕，王斌，徐银峰，等. 基于聚类分析法和双指标分析法的淡菜红外指纹图谱比较研究[J].中国食品学报，2013，13（1）： 178-182.

[6] Wang B， Zhang Y B， Li G Q， et al. Fingerprint chromatogram analysis of Radix Glehniae by LC coupled with hierarchical clustering analysis [J]. Chromatographia， 2009，70（5/6）： 811-816.

[7] 李蓉，唐旭利，李国强，等.海洋药用生物系列HPLC化学指纹图谱研究Ⅱ三斑海马HPLC化学指纹图谱研究[J].中国海洋大学学报，2009，39（4）： 729-734.

[8] 王海波，刘勇，邸学，等.远志HPLC多指标指纹图谱研究[J].中药材，2018， 41（2）： 391-393.

[9] 李江滨，黄迪南.贻贝的药用价值研究进展[J].水产科学，2004，23（11）： 41-44.

[10] 袁高峰，姚婷励，炯张治，等.厚壳贻贝脂溶性提取物抗炎生物活性研究[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版），2007，33（2）： 169-173.

[11] 王燕.海龙、海马与淡菜的指纹图谱研究[D].舟山：浙江海洋学院，2012.

[12] 孟志娟. 基于多元指纹图谱技术的带鱼产地鉴别与新鲜度评价研究[D]. 舟山：浙江海洋学院，2013.