不同自制植物环保酵素在不同发酵时间抗氧化力的对比研究

徐德金 陈智松 康天旭 刘佩勇

摘 要 为了对比不同原料的环保酵素抗氧化力的差异，自制了维生素C和番茄红素含量较高的8种环保酵素，分别测定不同浓度不同发酵时间环保酵素对羟基自由基、超氧自由基和DPPH自由基的清除能力。结果表明，8种酵素对各自由基的去除能力差别不大，其中维生素C含量较高的果蔬环保酵素对3种自由基的清除作用较好，酸枣酵素对羟基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齐酵素对超氧自由基的清除能力最好。随着环保酵素稀释倍数的增加，酵素对自由基的清除能力逐渐下降。羟基自由基、超氧自由基和DPPH 自由基的最大去除率分别可达 98.52%、96.98%和99.77%。为达到最大去除率，最佳酵素浓度均为原浓度，最佳发酵时间分别为9个月、3个月和9个月，但时间对清除能力的影响不明显。

关键词 环保酵素；发酵时间；抗氧化

中图分类号：TQ925 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.073

研究表明，酵素具有清除自由基的能力，蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是其主要的功效酶[1]，因此目前酵素主要用于农业改善土质[2]、减少虫害、增加土壤肥力和医药治疗皮肤病、抗炎、抗菌、抗症等方面[3-10]。近年来，环保酵素在环境污染治理方面的研究开始受到关注，但相关研究报道几乎空白。本实验以家庭中最常见的果蔬作为选材，研究结果可为日常生活中环保酵素的使用提供理论依据，利用这些果蔬制作的酵素或将取代市面上一些化学防腐剂，降低水果腐烂速度，使人体更加健康，同时起到废物重新利用的功能，促进环保。

1 实验材料

1.1 仪器和试剂

紫外分光光度计、高速离心机、水浴锅、比色皿、小试管、烧杯、量筒。

1.2 实验材料

酸枣环保酵素、草莓环保酵素、掐不齐环保酵素、猕猴桃环保酵素、西红柿环保酵素、西瓜环保酵素、番石榴环保酵素、番木瓜环保酵素。

2 实验方法

2.1 环保酵素制作

分别取酸枣、草莓、掐不齐、猕猴桃、西红柿、西瓜、番石榴、番木瓜为原料，将质量比为1∶3∶10的果蔬材料（切碎）、红糖、蒸馏水放入不同密封罐中，早期每天放气一两次，1个月后待无气放出置于阴凉处保存3个月。

2.2 检测方法

通过测量不同环保酵素在特定条件下的吸光度来计算其对3种自由基（超氧自由基、羟基自由基、DPPH自由基）的清除率，从而判断其抗氧化能力的强弱。

2.2.1 对羟基自由基的测量方法[2]

在FeSO4、H2O2、水杨酸-乙醇体系中，以水杨酸作为Fenton试剂反应产生的羟基自由基（-OH）的捕捉剂，在加入不同浓度环保酵素的情况下，测定酵素对羟基自由基的清除率。

向比色管中加入蒸馏水1.00 mL，1.8 mmol·L-1 FeSO4溶液2.00 mL，1.8 mmol·mL-1水杨酸-乙醇溶液1.50 mL，最后加入0.03% H2O2 0.10 mL，振荡混合，在波长510 nm处测定其吸光度值A0。另取比色管，向其中加入不同浓度酵素溶液1.00 mL，FeSO4溶液2.00 mL，水杨酸-乙醇1.50 mL，最后加0.03% H2O2 0.10 mL，振荡混合，水浴37 ℃下保温30 min后在波长510 nm下测量各自的吸光度值Ax，再另取比色管加入相同系列浓度的环保酵素1.00 mL和FeSO4溶液2.00 mL，水杨酸-乙醇1.50 mL，蒸馏水0.10 mL，在波长510 nm下测量吸光度值Ax0。上述三组试管的反应同时操作进行，以消除时间不均的误差。

将环保酵素与FeSO4溶液、水杨酸、乙醇、H2O2混合，37 ℃水浴加热30 min后在波长510 nm处测定其吸光度值。

羟基自由基清除率计算公式为：

式（1）中，A0为蒸馏水在相同条件下的吸光度值；Ax为添加H2O2的环保酵素吸光度值；Ax0为未添加H2O2的吸光度值。

2.2.2 对超氧自由基的测量方法[3]

試管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、双蒸水4.2 mL，于25 ℃恒温20 min后加入25 ℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol·L-1，盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm处每10 s测定一次吸光值A0，计算ΔA0。

试管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、双蒸水3.7 mL、环保酵素0.5 mL，于25 ℃恒温20 min后加入25 ℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol·L-1，盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm处每10 s测定一次吸光值ASOD，计算ΔASOD。

超氧自由基清除率计算公式为：

式（2）中，ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率；ΔASOD：样品光密度值变化速率。

2.2.3 对DPPH自由基的测量方法[4]

以2 mL蒸馏水+2 mL无水乙醇为空白对照，将2 mL不同浓度酵素液加入到2 mL 20 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液中，混匀后避光处放置30 min后，于波长517 nm处测定吸光度值Ai；同法测定2 mL无水乙醇和2 mL不同浓度酵素体系的吸光度值Aj，以及2 mL无水乙醇和2 mL

20 mmol·L-1的DPPH乙醇体系的吸光度值Ac。

DPPH自由基清除率计算公式为：

式（3）中，Ai为与DPPH-乙醇混合的环保酵素的吸光度值；Ac为无水乙醇与DPPH-乙醇混合后的溶液的吸光度值；Aj为与无水乙醇混合的环保酵素的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 同种酵素在不同发酵时间和不同稀释度下对羟基自由基的清除情况

图1和图2分别表示维生含量高和含番茄红素高的酵素对羟基自由基的清除率。由图可知，实验结果大体呈现出随着酵素稀释度的增加而明显减少的趋势，其中酸枣的变化最为规律，当稀释度≥50时的清除率相差不大，并且原浓度的清除率远大于稀释后的浓度。西瓜对羟基自由基的清除率随着稀释度的变化颇为异常，结果与时间的关系密切，6月份的清除率最大，其余时间的结果均过小。清除率随时间的变化规律多是先减少后上升，6种酵素在10月的清除率达到最大，6种酵素在5月的清除率达到最小。维生素C含量高的酵素普遍变化规律比较平缓，且自由基清除效果略优含番茄红素高的酵素。

3.2 同种酵素在不同发酵时间和不同稀释度下对DPPH自由基的清除情况

图3和图4分别表示维生素C含量高和含番茄红素高的酵素对DPPH自由基的清除率。8种酵素对DPPH自由基的清除率大体呈现出随着稀释度的增加而明显减少的趋势，并且各稀释度对应的清除率变化幅度较平缓，不同发酵时间下原浓度的清除率变化相差不大，在稀释50倍后逐渐出现较大变化，并且有5种酵素在5月的清除率最小，6种酵素在10月的清除率最大。维生素C含量高的酵素对DPPH自由基清除效果基本等同于含番茄红素高的酵素，但含番茄红素高的酵素变化规律普遍平缓一些。

3.3 同种酵素在不同发酵时间和不同稀释度下对超氧自由基的清除情况

图5和图6分别表示维生素C含量高和含番茄红素高的酵素对超氧自由基的清除率。以掐不齐为原料的酵素对超氧自由基的清除率大体呈现出随着稀释度的增加而明显减少的趋势，但是其他酵素的变化趋势十分异常，维生素C含量高和含番茄红素高的酵素对超氧自由基的清除率的变化规律均不明显。

4 结论与展望

在原浓度的情况下，环保酵素对羟基自由基、超氧自由基和DPPH自由基有着良好乃至完全清除作用，且清除能力与原材料关系不大。由于本实验的稀释浓度跨度大，要进一步探究环保酵素的最佳浓度还需要在0.2%～100%进行梯度浓度实验。

本实验中，维生素C含量较高的果蔬环保酵素对3种自由基的清除作用较好，酸枣酵素对羟基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齐酵素对超氧自由基的清除能力最好。随着环保酵素稀释倍数的增加，酵素对自由基的清除能力逐渐下降，时间对清除能力的影响不明显，进一步实验需要加长或缩短发酵周期。

实验中对环保酵素稀释后的对自由基的清除能力进行实验，从原浓度稀释到50倍后清除能力下降最快，提示实际使用中的稀释浓度应在0～50倍，以免环保酵素效果过低，最佳的稀释浓度需要进一步实验，也要考虑实际的需求。

环保酵素在环境污染治理方面的研究刚刚起步，可在环保酵素菌落组成及变化、活性成分分析分离与鉴定、环保酵素对污水COD、总氮、总磷乃至毒害有机污染物的清除效果和机理方面进一步开展研究，为后续环保酵素在环境治理方面的应用提供科学参考。

参考文献：

[1] 邹梦遥，吴俊良，胡卓，等.不同单一原料自制环保酵素抗氧化力初探[J].广东化工，2015，42（16）：296-297，287.

[2] Tsuruta T. Adsorption of uranium from acidic solution by microbes and effect of thoriumon uranium adsorption by Streptomyces levoris[J].J of Bioscience and Bioengineering，2004，97（4）：275-277.

[3] Nakajima A， Tsuruta T. Competitive biosorption of thorium and uranium by Micrococcus luteus[J].Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2004，260（1）：13-18.

[4] Bayramoglu G， Celik G， Arica M Y. Studies on accumulation of uranium by fungus Lentinus sajor-caju[J].Journal of Hazard Mater，2006，36（2）：345-353.

[5] Okada H， Fukushi E， Yamamori A， et al. Novel fructopyranose oligosaccharides isolated from fermented beverage of plant extract[J].Carbohydrate Research，2010，345：414.

[6] Kawazoe N， Okada H， Fukushi E， et al.Two novel oligosaccharides isolated from a beverage produced by fermentation of a plant extract[J].Carbohydrate Research，2008，343：549.

[7] 林高賢.常安镇利用“环保酵素”科技治水[J].政策瞭望，2014（9）：51-52.

[8] 杨柳，胡文忠，姜爱丽，等.鲜切果蔬加工废弃物发酵液的制备及功效性评价[J].现代园艺，2017（19）：7-8.

[9] 毛建卫，吴元锋，方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯，2010，39（3）：42-44.

[10] 董银卯，何聪芬，王领，等.火龙果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009，34（3）：192-196.

（责任编辑：赵中正）