降解上部烟叶大分子物质的复合酶配制与条件优化

沙云菲 董惠忠 张耀 马开玥 张薄博 许赣荣 陈磊

摘要：为降低上部烟叶中淀粉和蛋白质等大分子成分含量，提高其吸食品质，本研究在统一评价酶活力的基础上，选用4种酶制剂（淀粉酶IV.蛋白酶I、果胶酶I和纤维索酶II）配制复合酶制剂，采用单因素法和Box-Benhnken响应面分析法对影响酶解效果的复合酶量、缓冲液pH、含水量和酶解时间等因素进行优化。分析显示，4个因素对上部烟叶中淀粉和蛋白质降解率的影响顺序为：缓冲液pH>酶解时间>含水量>复合酶量。响应面分析结果确定最优酶解条件为：复合酶量1.1单位（即淀粉酶Ⅳ33U/g烟叶，蛋白酶I 550U/g烟叶，果胶酶1220U/g烟叶，纤维索酶II220U/g烟叶）、缓冲液pH 7.7、含水量54%、酶解时间5.5 h，此时淀粉和蛋白质降解率分别为19.54%和20.03%。本研究中的复合酶制剂及酶解条件可以很好地结合于烟草打叶复烤工艺过程中，具有较好的应用前景。

关键词：复合酶：上部烟叶：淀粉：蛋白质：响应面法

烤烟的上部烟叶包括上二棚叶和顶叶，共6～7片，占整株烟叶总产量的30%-40%。上部烟叶叶片较厚，组织结构较紧密，淀粉、蛋白质等大分子成分含量过高，燃烧后具有烟气浓度和劲头大、刺激性大、杂气重等缺点，工业可用性较差。

近年来的研究中，改善上部烟叶吸食品质的方法主要有3种：生物酶法、化学添加法、微生物发酵法。其中，生物酶法因为条件温和、易于操作、改善效果明显，在实际应用中具有一定优势。外加复合酶在较温和的条件下，将淀粉、蛋白质以及果胶、纤维素（细胞壁物质）等大分子物质分解成低聚糖、半乳糖醛酸、还原糖、短肽和氨基酸等以减少烟草原料的刺激性和杂气，改善吸食品质，提高其在烟草行业中的使用价值。然而，由于不同来源的市售酶制剂酶活单位定义不同，无法比较不同来源酶制剂的作用效果，导致实验得出的酶制剂使用量和配方无法重现。因此，虽然已有较多酶法改善上部烟叶品质的研究，但实际应用较少。

本研究选择4类生物酶（淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶），在对其进行统一酶活评价的基础上，以淀粉降解率和蛋白质降解率為评价指标，采用单因素法和响应面法对复合酶量、酶解条件进行优化，以缩短酶解时间，与现代烟草加工工艺相协调，使上部烟叶中淀粉和蛋白质的含量降低，同时增加水溶性糖分及氨基酸，使上部烟叶中各化学成分比例相对协调，从而改善上部烟叶的杂气、劲头和刺激性，为提高上部烟叶品质奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

上部烟叶B2F：上海烟草集团有限责任公司提供，2014年产于贵州，烟叶经切丝后用于酶解。盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、浓硫酸等，AR：酪蛋白、果胶、淀粉：半乳糖醛酸标品。以上试剂均由中国国药集团化学有限公司生产。

淀粉酶I，中温淀粉酶BAN 0.8L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：淀粉酶II，高温淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：淀粉酶III，高温淀粉酶（上海麦克林生化科技有限公司）：淀粉酶IV，低温淀粉酶（江苏锐阳生物科技有限公司）。蛋白酶I，中性蛋白酶0.8 L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：蛋白酶II，水解蛋白酶2.4 L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：蛋白酶III，中性蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）。果胶酶I，上海源叶生物科技有限公司：果胶酶II，江苏锐阳生物科技有限公司。纤维素酶I，上海麦克林生化科技有限公司：纤维素酶II，江苏锐阳生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

H2-2型电热恒温振荡水浴箱，上海精宏实验设备有限公司：TGL-16M型台式高速离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司：Enspire 2300多标记检测系统（酶标仪），美国PerkinElmer公司UV3000型紫外一可见光分光光度计，日本Himchi公司：MB45红外水分测定仪，美国OHAUS仪器有限公司：FA1004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司：SKD-200凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；SKD-0892红外智能消化炉，上海沛欧分析仪器有限公司。

1.3测定方法

1.3.1原料预处理

陈化后的上部烟叶经松散回潮、切丝、烘丝后，制得试验用长度均匀的烟丝（水分约12.5%，以红外水分测定仪测得）。

1.3.2烟丝的酶解精确称取（25.00±0.02）g烟丝置于筛网，于65℃水浴箱中保温回潮20 min，使烟丝水分含量约21%。将回潮结束的烟丝平铺于干净的20 cmx16 cm陶瓷托盘，按照一定料水比将酶液（pH 7.5磷酸缓冲液溶解并稀释）均匀喷洒在烟丝上，喷洒过程中常翻动烟丝使酶液混合均匀，以食品级密封袋密封好，于适当温度恒温箱中酶解。酶解结束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%-12.5%，待测。

1.3.3复合酶制剂配方中酶种类的选择在30～70℃范围内测试各种酶的活性变化，初步确定适合于多种酶类进行反应的温度，以及在此温度下活性较高的商品酶（淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶各1种）作为酶制剂的配方用酶，同时对酶的活性进行统一评价。根据所确定的酶解温度和酶种类，将1mL一定浓度的淀粉酶、果胶酶、纤维素酶分别与蛋白酶混合，在40℃下反应30 min，迅速将混合体系置于冷水中冷却，再测定各种酶的活性。以不添加蛋白酶的体系为对照，确定蛋白酶对其他酶活性的影响。

1.3.4单位复合酶制剂中各种酶添加量的确定以不同浓度的淀粉酶（2、5、10、30、50 U/g烟叶）、蛋白酶（100、250、500、1000、2000 U/g烟叶）、果胶酶（50、100、200、500、1000 U/g烟叶）、纤维索酶（50、100、150、200、300 U/g烟叶）分别以料水比20：1加料于烟丝，密封后于40℃恒温酶解30 min，按1.3.2所述烘干至水分含量12.0%-12.5%，测定各样品中相应成分含量，根据结果确定单位复合酶中各种酶的添加量。

1.3.5

复合酶处理上部烟叶单因素实验

根据1.3.4的试验结果选定复合酶配比，分别考察复合酶量（0.1、0.5、1、1.5、2单位）、缓冲液pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、含水量（20%、30%、40%、50%、60%、80%）、酶解时间（0.5、1、2、4、6、8、10 h）对酶解效果的影响。

1.3.6响应面优化酶解烟叶样品条件

使用软件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心组合设计响应面分析，设置以下4个因素复合酶用量（A）、缓冲液pH（B）、含水量（C）、酶解时间（D）1研究环境对酶解上部烟叶效果的影响。实验设计4因素3水平，响应面分析及因素如表1，每个实验重复3次。

1.3.7主要化学成分检测方法还原糖、可溶性总糖及淀粉含量的测定参照文献，蛋白含量测定参照GB 5009.5-2016方法，果胶含量的测定参照YC/T 346-2010方法，纤维素含量的测定参照范式（Van Soest）酸性洗涤纤维分析法。

1.4数据处理

所有试验均重复3次（n=3），试验数据采用Origin 7.0和Excel 2016软件进行统计分析和作图。

2结果

2.1酶制剂中适宜商品酶种类及酶解温度

如图1A所示，在40℃左右的环境下低温淀粉酶（淀粉酶Ⅳ）的酶活性高于其他淀粉酶。图1B示出，诺维信中性蛋白酶0.8 L（蛋白酶I）在45℃时活性相对于其他两种蛋白酶制剂更高。果胶酶和纤维素酶的最大酶活均出现在40-50℃温度范围（图1C，1D），而果胶酶I和纤维素酶II酶活更高。

综合以上结果，在进行复合酶处理上部烟叶实验中用于配制复合酶的各种酶制剂选定为：淀粉酶Ⅳ、蛋白酶I、果胶酶I、纤维素酶II。酶解温度选择40℃进行下一步试验。

经30min蛋白酶I酶解处理后，在pH 7.5，40℃下各種酶活性如表2所示。与未经蛋白酶处理的酶活性相比，分别添加蛋白酶I后对这些酶活性没有显著影响，说明蛋白酶对各种酶活性影响不大。因此在配制复合酶的过程中，蛋白酶I可以与3种酶制剂复配使用。由于其他三者均是针对专一性底物，相互间并无协同作用效果，因此，复合酶制剂中各类酶量配比可以由各种酶的单因素试验确定。

2.2单位复合酶制剂中的各种酶量配比

如表3所示，40℃下，当淀粉酶添加量为30 U/g时淀粉的降解效果最好。当蛋白酶添加量达到500 U/g时，蛋白的降解率趋于稳定，继续增大蛋白酶添加量对于蛋白质降解率影响不大。当果胶酶和纤维素酶添加量均达到200 U/g后，相应成分的降解率趋于稳定，继续增大酶添加量对于降解率影响不显著。因此复合酶中单一酶的添加量依次为：淀粉酶Ⅳ30U/g烟叶，蛋白酶I 500U/g烟叶，果胶酶I 200U/g烟叶，纤维素酶II 200U/g烟叶，用指定pH的缓冲液将各酶制剂配制为复合酶液，定义为复合酶1单位。

2.3复合酶制剂处理上部烟叶的单因素试验结果

如图2A所示，随复合酶量的增加，淀粉降解率呈逐步升高趋势，在复合酶量为1时趋于稳定。蛋白质和淀粉的降解率（图2B）在pH 5-8范围内随pH升高而升高，在pH 8-9时达到最高值。这可能与烟叶本身pH偏酸性（pH-5.5）有关，略高的pH起到了中和作用使最终pH维持在适合生物酶作用的范围。

随含水量增加（图2C），上部烟叶中淀粉和蛋白的降解率呈升高趋势。在水分含量达到60%时，烟叶中淀粉和蛋白的降解率趋于稳定。随酶解时间的延长（图2D），淀粉和蛋白降解率都呈增加趋势，淀粉降解率在6 h后逐步趋于稳定，而蛋白降解率在4h后即趋于稳定。

以上结果表明，反应温度40℃条件下，烟叶中淀粉和蛋白质的最优酶解条件为：复合酶添加量1（淀粉酶Ⅳ30U/g烟叶，蛋白酶I 500U/g烟叶，果胶酶I 200U/g烟叶，纤维素酶11200U/g烟叶），缓冲液pH 8，烟叶含水量60%，酶解时间6h。

2.4响应面试验

2.4.1响应面设计及结果在单因素实验基础上，使用软件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心组合设计响应面分析，分别以淀粉降解率和蛋白质降解率为响应值，取复合酶量（A）、缓冲液pH（B）、含水量（C）、酶解时间（D）为因素设计4因素3水平的响应面分析试验，试验设计与结果见表4。

2.4.2淀粉降解率模型的建立及其显著性检验采用Design-Expert软件对试验结果进行响应面回归分析，得到淀粉降解率对所选4个因素（即复合酶添加量、pH、含水量、酶解时间）的二次多项回归方程为：淀粉降解率/%=19.46+0.73A+1.18B+0.75C+0.99D-0.43AB-0.69AC+0.36AD-1.17BC-0.60BD+1.26CD-2.93A2-4.4482-2.82C2-3.43D。

由表5方差分析结果和图3目标函数的响应曲面图可以看出，各因素对淀粉降解率的影响顺序为：缓冲液pH>酶解时间>含水量>复合酶量，且缓冲液pH与含水量、含水量与酶解时间的交互作用显著（P<0.05）。

2.4.3蛋白质降解率模型的建立及其显著性检验采用软件对响应面结果进行回归分析，得到蛋白质降解率对所选4个因素的二次多项回归方程为：

由图4和表6可知，各因素对蛋白质降解率的影响顺序为：缓冲液pH>酶解时间>含水量>复合酶量，与淀粉降解率中的影响一致，而且缓冲液pH与含水量、缓冲液oH与酶解时间的交互作用显著（p<0.05），复合酶量与含水量、复合酶量与酶解时间、含水量与酶解时间的交互作用极显著（p<0.0001）。

2.4.4酶解条件的优化与验证

由表5和表6可知，两个模型的p值均小于0.0001，失拟项p>0.05，表明失拟不显著，且回归模型与实际实验拟合程度较好，实验方法可靠。模型的确定系数R2和校正确定系数R2adi均大于0.9，且两组值分别接近，表明模型预测值与实际实验结果具有良好的相关性。两个模型预测残差平方和均大于10，说明两个模型解释变差的能力较强，总体拟合具有统计学意义，可分别用来预测复合酶对上部烟叶中的淀粉和蛋白质降解率。

根据Design Expert 10.0.3软件中0ptimization的Numerical功能，在模型浓度范围内选择最低点为出发点，使用最大值优化，得到复合酶酶解上部烟叶淀粉和蛋白质的理论最佳条件（表7），在最佳理论条件下淀粉和蛋白质降解率的预测值分别为为19.69%和20.19%。

由表7亦可知，淀粉和蛋白质降解率最佳理论条件中各参数数值接近，考虑到实际实验条件的便利，为同时能达到两者的最高降解率，在40℃条件下，选择复合酶量1.1、pH 7.7、含水量54%、酶解时间5.5 h，取3次平行试验结果的平均值，进行验证试验和和重复性考察。如表8所示，试验测得淀粉降解率为19.54%，蛋白质降解率为20.03%，相对误差分别为0.76%和0.79%，试验值与预测值基本一致，说明该条件的优化结果具有较高准确率。该酶解条件下，果胶和纤维素等成分均有不同程度的降解，还原糖和可溶性总糖含量显著增加。对最优酶处理条件下所得烟丝样品进行感官评吸（表9），结果显示，酶处理后的烟丝比未处理的烟丝样品在杂气、劲头和刺激性等方面都有一定改善。可见，以响应面法优化后的酶解条件处理上部烟叶后，蛋白质、淀粉等主要大分子成分含量显著降低，同时还原糖、可溶性总糖含量及施木克值显著提高，上部烟叶中各化学成分的协调性得到了明显提升，对于提高上部烟叶品质具有一定的意义。

3讨论

上部烟叶中含量较高的大分子成分对其品质影响较大。淀粉含量较高时，会影响燃烧速度，使燃烧不完全，产生糊焦味。蛋白质含量高，在燃烧时会产生不良气味，并提高烟气pH值而增加烟气劲头和刺激性。纤维素有烧纸味：果胶有木质气，杂气重、余味差、对口腔刺激性大，会改变烟气状态。此外在调制后的烟叶中，蛋白质、淀粉会与纤维索、果胶质等共存，且不易分离。而预试验结果表明，加入果胶酶和纤维素酶可以大大增强蛋白酶、淀粉酶的降解效率。故将蛋白酶、淀粉酶与细胞壁降解酶（果胶酶、纤维素酶）结合使用，果胶酶和纤维素酶的作用为适度降解烟叶细胞壁，使淀粉酶和蛋白酶可以更为充分地起到降解作用。

文中酶解后烟叶中的还原糖、可溶性总糖含量的提高幅度高于淀粉、果胶、蛋白质及纤维素的降解量，可能由于酶制剂在酶解过程中不仅作用于淀粉、果胶、纤维素等不溶性大分子成分，还会作用于其他多聚体或低聚体成分，其机理有待于进一步研究。

本研究中经优化后的酶解最佳水分含量为54%（含烟叶本身12.5%的水分），在该水分条件下进行烟丝喷洒试验，通过对比酶处理前后的评吸效果，不会造成烟丝香味物质的损失。本研究所得复合酶制剂处理上部烟叶的酶解条件可用于打叶复烤阶段，在打叶去梗及筛分之后的加料配叶过程利用现有加料设备进行复合酶液的喷洒，并增加储叶过程，在所优化的条件下进行酶解处理，以降低上部烟叶中的淀粉和蛋白质含量，无须额外增加大规模的生产处理设备。在之后的烟片复烤阶段，经90℃左右复烤使烟叶中水分降低至12.5%左右，并将所添加的复合酶变性失活，可避免其在下一步的装箱醇化过程中对烟叶品质继续产生影响。因此，本研究所述复合酶的添加及作用条件可以很好的结合于烟草的生产工艺过程中，具有较好的应用前景。

本文所采用的响应面分析法利用合理的试验设计进行实验得到数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，以解决多变量问题，对于实验结果的得出具有非常重要的意义。由于复合酶和上部烟叶都是复合体系，底物和酶的种类较多，因此无法进行简单的酶动力学分析，今后需考虑建立复杂的数学模型，对复合酶降解烟叶中大分子成分的动力学展开更为深入的探讨。

4结论

本研究在统一酶活评价的基础上，通过单因素试验和Box-Behnken响应面设计，得出降解上部烟叶中淀粉和蛋白质的最佳条件为：复合酶量配比为：淀粉酶Ⅳ33u/g烟叶、蛋白酶I 550U/g烟叶、果胶酶I 220U/g烟叶、纤维素酶11220U/g烟叶，pH7.7、含水量54%、酶解时间5.5 h。此时淀粉和蛋白质降解率分别为19.54%和20.03%，实验值与预测值基本一致，该酶解条件的优化结果具有较高准确率和可靠性。酶处理后，烟叶的杂气、劲头和刺激性明显改善。上述研究成果為上部烟叶的品质提升奠定了基础。