花生网斑病不同病斑类型及其病原菌致病力差异

李绍建　高蒙　王娜　崔小伟　刘春燕　王振宇

摘要

本文描述了河南省发生日趋严重的花生网斑病在田间出现的一种新的病斑类型，并结合已报道的两种病斑类型，对3种病斑类型的病原菌开展致病力差异研究。研究结果表明：田间新发现的花生网斑病病斑特征明显，综合分析后将花生网斑病病斑类型分别定为网纹型、类褐斑型和污斑型；同一花生品种上3种病斑类型病原菌菌株间存在明显的致病力差异，同一病斑类型菌株对不同花生品种的致病力也表现出显著差异。

关键词

花生网斑病； 病斑类型； 病原菌； 菌株； 致病力差异

中图分类号：

S 435.652

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017295

Different lesion types of peanut web blotch and virulence

differences of their pathogens

LI Shaojian， GAO Meng， WANG Na， CUI Xiaowei， LIU Chunyan， WANG Zhenyu

（Henan Key Laboratory of Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Crops in Southern Region of North China， Institute of Plant Protection，Henan Academy of

Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

A new lesion type of peanut web blotch caused by Peyronellaea arachidicola was described and the virulence differences of the pathogens resulting in different lesion types were investigated in this research. By a comprehensive analysis of the lesion features， three lesion types of peanut web blotch were sorted， including type of reticulate elongation， type of brown spot like and type of irregular stain. Furthermore， virulence test showed that virulence was significantly different not only among pathogens caused three lesion types on the same peanut cultivar， but also among the peanut cultivars caused by same pathogen with the same lesion type.

Key words

peanut web blotch； lesion type； pathogen； strain； virulence difference

花生Arachis hypogaea Linn.是重要的油料和经济作物，其生产遍布世界各大洲100多个国家。目前，中国是世界上最大的花生生产、消费和贸易出口国，花生在我国国民经济发展和对外贸易中占有重要地位[1]。河南省是中国传统花生大省，其花生种植面积自2004年以来一直稳居我国第一位[23]。近年来，河南省花生网斑病发生日趋严重，造成叶片提早脱落，影响花生后期灌浆成熟，严重影响产量。

花生网斑病最早于1972在美国德克萨斯州发现[4]。在我国，该病于1982年在山东、辽宁等省的花生主产区首次发现，随后陕西、河南等省也相继报道了该病[56]。目前，普遍被学者接受的花生网斑病病原菌为花生茎点霉Phoma arachidicola，这一名称最早是由Marasas等[7]于1974年研究南非发现的花生网斑病时据其形态学特征而命名的。一直以来，花生网斑病病原菌的属级分类地位较为混乱，出现了许多不同的命名，直至2010年Aveskamp等[8]对茎点霉属Phoma进行系统发育分析，将原茎点霉属下的派伦霉节（section）升为派伦霉属，并将花生网斑病病原菌归到此属，因此本文沿用上述最新的名称花生派伦霉Peyronellaea arachidicola。

截至目前，有关花生网斑病发生危害及防治的研究报道较多，而对于其病原菌致病力的系统研究较少。有鉴于此，结合本课题组在田间调查时新发现的一种花生网斑病病斑类型，本文对花生网斑病3种病斑类型进行特征区分，并进一步对3种病斑类型的病原菌致病力差异开展研究，以期指导田间病害识别，并为病害的深入研究及抗性品系筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及花生品种

花生网斑病不同病斑类型病叶分别采集于河南省南阳市新野县高庙乡仁桥村（网纹型）、新野县北王庄（类褐斑型）及河南省农业科学院原阳基地（污斑型），经室内组织分离并纯化后保存菌株。

供试花生品种为‘开农1760、‘兴花6号、‘豫花9327、‘豫花22、‘豫花15、‘遠杂9102。

1.2 病害症状描述

根据花生网斑病田间危害症状特点进行描述记载。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 病原菌形态特征

刮取病原菌菌落，显微观察，并参考《中国真菌志》[9]及《The genera of hyphomycetes》[10]描述其形态特征；将纯化的病原菌菌株用PDA平板活化，25℃光照培养箱培养，观察菌落颜色、形状以及菌丝疏密程度等。

1.3.2 柯赫氏法则验证

选用有6～8片真叶的‘豫花22进行致病性测定。病原菌接种采用菌丝悬浮液涂抹法（菌丝片段长度约100～200 μm，浓度为1.6×10-3g/mL），以清水接种为对照。每处理3次重复，每次重复6片复叶。接种后每片复叶套自封袋保湿，花生植株均置于28℃条件下培养，逐日观察并记录接菌植株叶片发病情况。

1.3.3 病原菌rDNAITS序列分析

采用上海莱枫生物科技有限公司的真菌基因组DNA小量提取试剂盒提取菌株基因组DNA。选用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）对病原菌基因组DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.0 μL，引物ITS1/ ITS4各1 μL， 模板DNA 1 μL，ddH2O 10 μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸50 s，32个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。

1.4 致病力测定

1.4.1 接种体制备

分别挑取3种病斑类型的病原菌菌株移植于PDA平板中，25℃的光照培养箱（L∥D=12 h∥12 h）中恒温培养10 d，随后在超净工作台内分别将菌丝刮入装有灭菌玻璃珠的2 mL PE离心管中，在离心管内加入200 μL无菌水，于Bullet Blender STORM研磨仪（Next Advance）8档研磨45 s，取出研磨液并稀释至菌丝浓度为1.6×10-3g/mL，按0.15%加入吐温20后摇匀备用。

1.4.2 接种及调查

选取长势一致的花生幼苗（苗龄20～30 d），采用菌丝悬浮液涂抹法接种，用无菌棉签蘸取菌丝悬浮液，均匀涂抹到叶片正面，接种完成后做好标记并将每片复叶套封口袋保湿，所有接种的花生植株置于25℃的人工气候箱（L∥D=12 h∥12 h）内培养，每个菌株接种设3次重复。

接种后14 d调查，记录总叶数、发病叶片数，所有的发病叶片拍照留存，计算发病率及病情指数。叶片发病分级方法如下：0级，无病斑；1级，病斑面积占整片叶面积的6%以下；3级，病斑面积占整片叶面积的6%～25%；5级，病斑面积占整片叶面积的26%～50%；7级，病斑面积占整片叶面积的51%～75%；9级，病斑面积占整片叶面积的75%以上[11]。病情指数计算公式为：

病情指数=[Σ（相对级值×各级发病叶片数）/（调查总叶数×9）]×100。

1.5 数据分析

运用IBM SPSS Statistics 22软件对文中数据进行单因素方差分析，显著性测验选用LSD法。

2 结果与分析

2.1 病害症状描述

调查发现，河南省花生网斑病共可分为3种病斑类型：网纹型、类褐斑型和污斑型（图1）。三者的病状表现区分较为明显，网纹型：病斑较大，直径1～2 cm，在叶片正面形成边缘网状扩展，中间为褐色的病斑。病斑不规则，边缘不清晰，一般不穿透叶片，田间发生往往多个病斑连在一起形成更大的病斑，严重时甚至可以遍布整片叶片（图1a）；类褐斑型：病斑相对较小，直径0.1～0.5 cm，近圆形，病斑中央黑褐色，边缘清晰，周围有黄色晕圈，可以穿透叶片（图1b）；污斑型：病斑一般较类褐斑型大，直径0.4～1 cm，病斑不规则形，黑褐色，边缘清晰，周围无黄色晕圈，可以穿透叶片（图1c）。

2014年-2016年对花生网斑病的采样结果显示，在河南省境内，花生网斑病的3种病斑类型以网纹型分布最广，类褐斑型次之，污斑型分布最少。类褐斑型与污斑型分布地区相对重合，目前仅在新乡、焦作、洛阳和南阳四市范围内采集到病害样本（图2）；对不同地区3种病斑类型的发病率调查数据显示，3种病斑类型在河南省境内均分别表现为由南向北发病率逐渐升高的趋势，并且随2014年至2016年的时间顺序，3种病斑类型田间发病率均分别逐年降低（表1）。

2.2 病原菌鉴定结果

2.2.1 病原菌菌落形态特征

3种病斑类型的病原菌在PDA培养基上的菌落特征存在差异。网纹型病原菌菌丝致密，灰白色，菌落边缘内侧有轮纹；类褐斑型病原菌菌丝较稀疏，菌落中央菌丝浅绿色，外围灰白色，菌落边缘菌丝生长茂盛，内侧有轮纹；污斑型病原菌菌丝致密，灰白色，菌落中央氣生菌丝茂盛，菌落边缘菌丝生长茂盛，内侧无轮纹（图3）。在实验室内相同条件分别继代培养后，3种病斑类型的病原菌菌落特征稳定。

2.2.2 柯赫氏法则验证结果

3种病斑类型的病原菌均引起花生叶片发病，而相应的清水对照处理的叶片均未发病。接种15 d后，3种病斑类型病原菌接种的花生叶片均分别表现出与原病斑类型一致的症状；分别取3种病斑类型的叶片进行再次分离，均获得了与原菌株相同的病原菌，证明3个类型的菌株均为花生网斑病的致病菌且回接后叶部症状表现与原病斑类型一致。

2.2.3 病原菌rDNAITS序列分析结果

利用引物ITS1/ITS4分别对3种病斑类型的病原菌进行rDNAITS序列扩增，均扩增出大小为530 bp的条带（图4）。将测序所得序列上传至NCBI进行BLAST比对分析，结果显示，3种病斑类型的病原菌均与GenBank登录号为JX898682的花生派伦霉Peyronellaea arachidicola，即目前普遍被学者接受的花生茎点霉Phoma arachidicola序列相似性达到99%，因此鉴定3种病斑类型的病原菌均为花生派伦霉Peyronellaea arachidicola。

基于3种病斑类型病原菌的ITS序列，用Clustal X（1.83）[12]多序列对位排列程序对3个序列进行对位排列，由分析结果可知，3种病斑类型病原菌的ITS序列完全一致。

2.3 不同病斑类型病原菌菌株的致病力

通过菌丝悬浮液涂抹接种法，将花生网斑病3种不同病斑类型的病原菌菌株分别接种在6个河南省花生主栽品种上，对菌株的致病性进行测定。接种7 d后，网纹型病原菌菌株接种叶片上显现不规则的黑色小病斑，病斑边缘不明显且呈不规则网状延伸；类褐斑型病原菌菌株接种叶片上显现近圆形褪绿斑，随着病斑发展，病斑中央褐色，周围有黄色晕圈；污斑型病原菌菌株接种叶片上显现不规则的黑色病斑，病斑中央黑色，边缘分界明显。

不同病斑类型的病原菌菌株对不同的花生品种表现出不同的致病力（表2）。接种网纹型菌株的6个花生品种全部发病，其中发病率最高为‘豫花9327，达95.00%，病情指數最高为‘开农1760（17.78），发病率与病情指数最低均为‘远杂9102；接种类褐斑型菌株的花生品种中，除‘兴花6号没有发病外，其他5个品种均发病，‘远杂9102上的发病率与病情指数分别为10.00%和0.56，相较其他品种均较低，发病率与病情指数最高均为‘豫花22；接种污斑型菌株的6个花生品种全部发病，其中发病率与病情指数最高均为‘开农1760，分别为90.00%和22.22，最低均为‘远杂9102，分别为50.00%和9.36。另外，除接种类褐斑型菌株的‘豫花22上发病率与病情指数均高于接种网纹型的菌株外，其他品种上均表现为接种类褐斑型菌株的发病率和病情指数最低。

3 结论与讨论

目前，文献报道的花生网斑病田间表现型通常有两种：一是污斑型，病斑较小，近圆形，周围有黄色晕圈；另一种是网纹型，病斑较大，病斑网纹状或星芒状，病斑不规则形，边缘不清晰，周围无黄色晕圈[13]。本研究通过田间采样调查，发现一种新的花生网斑病的病斑类型，病状表现为病斑相对较小，不规则形，边缘清晰，周围无黄色晕圈。经室内分离、柯赫氏法则验证及ITS测序，证实新发现病斑类型确为花生网斑病所致病症。文献表述的污斑型周围有黄色晕圈，在田间识别时与花生褐斑病难以区分；本文新发现病斑类型周围虽无明显黄色晕圈，但其余特征均与文献报道污斑型病状相似。因此，为更好指导田间花生网斑病识别，本文拟将之前文献报道原污斑型改为类褐斑型，新发现病斑类型拟定为污斑型，网纹型保持不变，即花生网斑病病斑的3种表现类型：网纹型、类褐斑型和污斑型。基于本研究中2014年至2016年花生网斑病病斑类型的调查数据，3种病斑类型在河南省境内3年内均分别表现为由南向北发病率逐渐升高的趋势，说明花生网斑病近3年来在河南省的发病规模正不断扩大，对3种病斑类型在地理上的发病趋势还有待进一步深入研究。

一直以来，关于花生网斑病病原菌的属级分类比较混乱。自1974年西方学者Marasas等在南非发现花生网斑病并据其形态学特征将该菌定名为茎点霉属一新种——花生茎点霉Phoma arachidicola Marasas， Pauer & Boerema[7]以来，针对该菌曾陆续有过Mycosphaerella arachidicola Chochrjakov， M. argentinensis Frezzi， Didymella arachidicola （Chochrjakov） Tomilin， D. arachidicola （Chochrjakov） Taber， Pettit & Philley和Didymosphaeria arachidicola （Chochrjakov） Alcorn， Punithalingam & McCarthy的不同命名[14]。随着近代分子生物学技术的发展，2010年Aveskamp等[8]通过对茎点霉属真菌进行系统发育分析，将原来茎点霉属Phoma下的派伦霉Peyronellaea节（section）及另外一些节的真菌归类并升为派伦霉属，花生网斑病病原菌即被划至此属内。因此，本文中花生网斑病病原菌使用拉丁学名为Peyronellaea arachidicola。

对不同病斑类型菌株致病力研究结果表明，同一病斑类型菌株对不同花生品种的致病力差异明显。以田间危害范围最广的网纹型菌株为例，网纹型菌株对‘开农1760、‘兴花6号和‘豫花9327的致病力相对较强，而对‘豫花22、‘豫花15和‘远杂9102的致病力相对较弱。综合分析3种病斑类型对不同品种的致病力，可知‘远杂9102为对3种病斑类型菌株抗性均较好的花生品种。此外，不同病斑类型菌株对同一花生品种的致病力差异也十分明显，在‘开农1760、‘豫花15及‘远杂9102上均表现为污斑型>网纹型>类褐斑型；在‘兴花6号和‘豫花9327上表现为网纹型>污斑型>类褐斑型；而在‘豫花22上，污斑型菌株的致病力最强，类褐斑型次之，网纹型最弱。这说明在供试的6个花生品种中，除‘豫花22外，污斑型和网纹型的致病力均明显大于类褐斑型。董炜博等鉴定了来自中国山东、河南、辽宁、湖北和美国的20多个花生品种（系）对花生叶部病害的抗性[15]，袁虹霞等测定了河南13个花生品种（系）对褐斑病、黑斑病和网斑病的抗性[16]，结果均表明供试品种中缺乏免疫和高抗花生网斑病的花生品种（系）。近年来，花生网斑病的发生危害规模逐渐增大，危害程度逐年加深，加之抗性品种（系）相对缺乏，因此生产上急需一批抗性良好的花生品种（系）来改善花生生产现状。本文结合花生网斑病病斑类型分布特点，分病斑类型进行花生抗性品种（系）的筛选，将为花生抗性品种（系）选育及品种推广提供一种新的思路。

本文研究结果明确了田间花生网斑病的3种不同病斑类型以及其在河南省各地区的分布情况，这极大地方便了花生网斑病的田间识别调查。同时还创造性地对3种不同病斑类型病原菌菌株开展了致病力差异研究，为更好地研究花生网斑病发生发展规律、田间防治及花生品种推广提供了重要的理论依据。

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（责任编辑：杨明丽）