基于16S rDNA序列的小贯小绿叶蝉共生细菌多样性研究

毛迎新 谭荣荣 王友平 陈勋 王红娟 黄丹娟 龚自明

摘要

利用Illumina HiSeq技術，对赤壁、大悟、武汉、咸安和英山5个茶园小贯小绿叶蝉地理种群的成虫共生细菌16S rDNAV4变异区进行测序，应用Uparse和RDP Classifier等软件统计和分析样本的物种组成、丰度和多样性。5个地区小贯小绿叶蝉成虫的16S rDNA基因序列文库共获得239 645条有效tags，在97%相似阈值下将其聚类为3 403个OTUs。共注释到41个门，116个纲，197个目，272个科，372个属，105个种。5个样本的共生菌在不同分类水平上的组成有所不同，其中在门水平上，主要优势菌为变形菌门Proteobacteria（相对丰度60.6%～97.1%）；在纲水平上，相对丰度排名前5位中共有的优势菌为γ变形菌纲Gammaproteobacteria和α变形菌纲Alphaproteobacteria；在属水平上，排名前10位中5个样本共有的优势菌为盐单胞菌属Halomonas、希瓦氏菌属Shewanella和沃尔巴克氏体属Wolbachia。小贯小绿叶蝉成虫细菌的Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数分别为1 065.55～2 841.89，1 130.76～2 914.90，1.07～8.63和0.18～0.99。茶园小贯小绿叶蝉成虫共生细菌多样性比较丰富，不同地理种群的小贯小绿叶蝉细菌群落结构和多样性有差异。本研究结果为进一步研究细菌对小贯小绿叶蝉种群生物学的影响奠定了基础。

关键词

小贯小绿叶蝉； 细菌； 16S rDNA； 多样性

中图分类号：

S 433.39

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017347

Analysis of the bacterial diversity in adults of Empoasca （Matsumurasca）

onukii based on 16S rDNA sequences

MAO Yingxin1， TAN Rongrong1， WANG Youping2， CHEN Xun1，

WANG Hongjuan1， Huang Danjuan1， GONG Ziming1

（1. Institute of Fruits and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China；

2. Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizers， Hubei Academy of Agricultural Sciences； Key Laboratory of

Integrated Pest Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture，Wuhan 430064， China）

Abstract

The V4 regions of the 16S rDNA of symbiotic bacteria in adults of Empoasca （Matsumurasca） onukii from five geographical regions including Chibi， Dawu， Wuhan， Xianan and Yingshan were sequenced by Illumina HiSeq techniques. The numbers of operational taxonomic units （OTUs）， bacterial community， species abundance and alpha diversity in samples were analyzed by using Uparse and RDP Classifier software. The results showed that a total of 239 645 effective tags were obtained， which were clustered into 3 403 OTUs， and annotated into 41 phyla， 116 classes， 197 orders， 272 families， 372 genera， and 105 species. At the phyla level， Proteobacteria was the common dominant bacteria （relative abundance 60.6%-97.1%）. Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria were the commonly dominant classes in the top 5 classes of bacterial communities between the five samples. Halomonas， Shewanella and Wolbachia were the commonly dominant genera in the top 10 genera of bacterial communities. The indexes of Chao， Ace， Shannon and Simpson were 1 065.55-2 841.89， 1 130.76-2 914.90， 1.07-8.63 and 0.18-0.99， respectively. The results indicated that there are diverse bacteria in adults of E.（M.）onukii，and there are differences in the bacterial community diversity among E.（M.）onukii populations. These results provide a basis for further study of the effects of bacteria on the biology of E.（M.）onukii.

Key words

Empoasca （Matsumurasca） onukii； bacterium； 16S rDNA； diversity

昆虫携带共生菌是一种普遍存在的自然现象。在长期的协同进化过程中，昆虫与其内共生菌之间形成了稳定的互惠共生关系[1]。昆虫为共生菌提供稳定的生存环境，共生菌在昆虫生命活动中起着重要的作用，如为宿主昆虫提供必需的营养物质，维持宿主昆虫的正常生长发育[2]，增强宿主对病原微生物、天敌等生物胁迫的抵御能力[34]，提高宿主的生殖力及雌性比例[5]，调节宿主昆虫对环境和寄主植物的适应性等[67]。共生菌对宿主昆虫有着重要的生物学和生态学意义，因此，有关内共生菌的多样性与功能研究也备受关注。

小贯小绿叶蝉 Empoasca （Matsumurasca） onukii 是我国茶区普遍发生的重要害虫，主要以成虫和若虫刺吸为害茶树嫩茎、嫩叶，雌虫产卵会给嫩茎造成机械损伤，严重影响茶叶产量和品质。该叶蝉原属林木中的一种非适生性害虫，当茶树向山区、半山区发展时侵入茶园，并很快蔓延发展成为茶园最主要的优势虫种[8]，在该虫定殖、扩散和暴发的过程中某些内共生菌可能就起着重要的作用。但目前我国还没有小贯小绿叶蝉内共生菌种类、功能研究的相关报道。为此，本研究利用16S rDNA基因文库技术和Illumina HiSeq测序技术，对来自湖北不同茶园的小贯小绿叶蝉内共生细菌群落结构及其多样性进行了检测分析，以期为进一步研究内共生菌对小贯小绿叶蝉生物学、生态学的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试虫来源及DNA提取

2015年6月，从湖北省英山縣、咸安区、赤壁市、大悟县和武汉市茶园分别采集小贯小绿叶蝉成虫，每个样点100头。采样茶园的具体地点、地理坐标以及种植的茶树品种等详见表1。设置5个不同地理种群的样本，即英山种群（YS）、咸安种群（XA）、赤壁种群（CB）、大悟种群（DW）和武汉种群（WH），每个种群随机选取50头成虫，用75%乙醇表面消毒90 s，灭菌水清洗5次后，用上海生物工程有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒对样本的基因组DNA进行提取。

1.2 16S rDNA的扩增

以提取的基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物515F（5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA3′） 和 806R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）扩增V4片段。PCR反应体系为30 μL：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物（2 μmol/L）3 μL， gDNA（1 ng/μL）10 μL，ddH2O 2 μL。PCR条件：98℃预变性1 min；98℃ 10 s， 50℃ 30 s， 72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。

1.3 PCR产物的纯化

PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，切取的目的条带，使用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit胶回收试剂盒回收纯化产物，方法参照试剂盒说明书。

1.4 文库构建及高通量测序

回收的目的片段，用TruSeq DNA PCRFree Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit定量试剂盒PCR定量，文库合格后，使用Hiseq2500 PE250进行上机测序。

1.5 测序数据处理

采用Illumina HiSeq 测序平台得到的原始数据（raw PE），存在一定比例的干扰数据（dirty data），为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先要进行拼接和质控，得到clean tags，再进行嵌合体过滤，得到最终用于后续分析的有效数据（effective tags）。

1.6 共生细菌鉴定与多样性分析

利用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）[9] 对所有样品的全部有效数据进行聚类，以97%的一致性（identity）将序列聚类成为操作分类单元OTUs （operational taxonomic units），筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。用RDP Classifier （Version 2.2， http：∥sourceforge.net/projects/rdpclassifier/）方法与GreenGene数据库（http：∥greengenes.lbl.gov/cgibin/nphindex.cgi）对OTUs代表序列进行物种注释分析，在不同分类水平上统计各样本的群落组成。并对 OTUs 进行丰度、多样性指数分析。选取Chao和Ace指数反映微生物丰富度，用Simpson和Shannon指数反映微生物多样性。

2 结果与分析

2.1 序列拼接和组装

小贯小绿叶蝉成虫的16S rDNA序列文库共获得了239 645条有效tags，以97%的一致性作为相似性的阈值将序列聚类为3 403个OTUs。其中，赤壁小贯小绿叶蝉种群共有54 060条有效tags，聚类为2 633个OTUs；大悟种群共有45 165条有效tags，聚类为2 370个OTUs；武汉种群共有35 062条有效tags，聚类为1 108个OTUs；咸安种群共有71 534条有效tags，聚类为1 065个OTUs；英山种群共有33 824条有效tags，聚类为2 109个OTUs（表2）。

2.2 小贯小绿叶蝉内共生细菌种类及其丰度

根据OTUs的注释结果，5个不同地理种群样本合并后的总样本共鉴定获得41个门，116个纲，197个目，272个科，372个属，105个种；其中赤壁种群鉴定出37个门，101个纲，170个目，243个科，340个属，91个种；大悟种群鉴定出32个门，100个纲，165个目，237个科，301个属，81个种；武汉种群鉴定出27个门，86个纲，130个目，183个科，202个属，45个种；咸安种群鉴定出28个门，84个纲，73个目，167个科，187个属，48个种；英山种群鉴定出36个门，103个纲，162个目，232个科，281个属，82个种（表3）。

在门分类水平上（图1），小贯小绿叶蝉成虫共生细菌的16S rDNA基因序列共注释到了酸杆菌门Acidobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、绿弯菌门Chloroflexi、蓝细菌门Cyanobacteria、厚壁菌门Firmicutes、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、变形菌门Proteobacteria和疣微菌门 Verrucomicrobia等41个门。5个地理种群样本共生菌的优势菌门均为变形菌门。但不同样本共生菌的门的类别及相对丰度有所不同，如排名前5位的门中，赤壁样本依次为变形菌门（61.7%）（括号中的数值为相对丰度，下同）、厚壁菌门（11.3%）、放线菌门（7.4%）、拟杆菌门（5.5%）和酸杆菌门（2.4%）；大悟样本依次为变形菌门（71.8%）、放线菌门（6.6%）、拟杆菌门（5.1%）、厚壁菌门（4.6%）和蓝细菌门（3.2%）；武汉样本依次为变形菌门（84.6%）、蓝细菌门（8.3%）、放线菌门（1.9%）、拟杆菌门（1.1%）和厚壁菌门（1.1%）；咸安样本依次为变形菌门（97.1%）、厚壁菌门（0.9%）、放线菌门（0.4%）、拟杆菌门（0.3%）和酸杆菌门（0.2%）；英山样本依次为变形菌门（60.6%）、厚壁菌门（14.1%）、拟杆菌门（6.0%）、放线菌门（5.4%）和酸杆菌门（3.1%）。

在纲分类水平上（表4），共注释了γ变形菌纲Gammaproteobacteria、α变形菌纲Alphaproteobacteria、梭菌纲Clostridia、β变形菌纲Betaproteobacteria、放线菌纲Actinobacteria、芽胞杆菌纲Bacilli、拟杆菌纲Bacteroidia、δ变形菌纲Deltaproteobacteria、黄杆菌纲Flavobacteriia、芽单孢菌纲Gemmatimonadetes、嗜热油菌纲Thermoleophilia等116个纲。在相对丰度排名前5位的菌纲中，5个样本共有的为γ变形菌纲和α变形菌纲，属于优势菌，二者之和在5个样本中的占比分别为，赤壁53.2%，大悟57.4%，武汉83.3%，咸安96.8%，英山53.9%。

在目分类水平上（表5），5个样本共注释到了197个目，其中赤壁样本的共生细菌主要有海洋螺菌目（24.0%）、梭菌目（9.0%）、放线菌目（5.5%）、根瘤菌目（5.4%）和鞘脂单胞菌目（4.5%）；大悟样本的共生细菌主要有海洋螺菌目（27.2%）、交替单胞菌目（7.4%）、普罗卡杆菌目（6.0%）、放线菌目（4.7%）、伯克氏菌目（4.6%）；武汉样本的共生细菌主要有肠杆菌目（69.9%）、假单胞菌目（3.9%）、气单胞菌目（2.8%）、放线菌目（1.4%）；咸安样本的共生细菌主要有立克次氏体目（92.7%）、海洋螺菌目（1.6%）、梭菌目（0.6%）、交替单胞菌目（0.5%）、假单胞菌目（0.5%）；英山样本的共生细菌主要有海洋螺菌目（11.1%）、梭菌目（8.6%）、立克次氏体目（7.6%）、红细菌目（7.0%）、交替单胞菌目（5.3%）。在相对丰度排名前10位的优势菌目中，5个样本共有的为海洋螺菌目、放线菌目、根瘤菌目和鞘脂单胞菌目（表5）。

在科分类水平上（表6），共注释到了272个科，主要有盐单胞菌科、鞘脂单胞菌科、肠杆菌科、希瓦氏菌科、黄单胞菌科、立克次氏体科、毛螺菌科、假单胞菌科、瘤胃菌科、普罗卡杆菌科、丛毛单胞菌科等。在相对丰度排名前10位的科中，5个样本共有的为盐单胞菌科、鞘脂单胞菌科、希瓦氏菌科、肠杆菌科、黄单胞菌科。但不同样本的共生菌在科的类别和丰度上有所不同，如相对丰度排名前5位的科中，赤壁样本中丰度最高的为盐单胞菌科（23.8%），随后依次为鞘脂单胞菌科（4.1%）、毛螺菌科（4.0%）、希瓦氏菌科（3.2%）和假單胞菌科（2.9%）；大悟样本中丰度最高的为盐单胞菌科（27.1%），随后依次为希瓦氏菌科（7.0%）、普罗卡杆菌科（6.0%）、鞘脂单胞菌科（3.7%）和丛毛单胞菌科（3.1%）；武汉样本中丰度最高的为肠杆菌科（69.8%），随后依次为假单胞菌科（3.5%）、气单胞菌科（2.6%）、鞘脂单胞菌科（1.1%）和盐单胞菌科（1.0%）；英山样本中丰度由高到低依次为盐单胞菌科（10.8%）、红细菌科（6.9%）、海洋细菌科（6.9%）、毛螺菌科（4.0%）和希瓦氏菌科（3.2%）；而咸安样本中立克次氏体科相对丰度最高（92.6%），随后依次为盐单胞菌科（1.6%）、希瓦氏菌科（0.5%）、假单胞菌科（0.4%）和肠杆菌科（0.4%）。

在属分类水平上（表7），共注释到了372个属。在相对丰度排名前10的菌属中，5个样本共有的为盐单胞菌属、希瓦氏菌属、沃尔巴克氏体属。不同样本的优势菌属有所不同，赤壁、大悟和英山样本的优势属为盐单胞菌属（23.8%、27.1%和8.8%），武汉样本的优势属为泛菌属（61.2%），咸安样本的优势属则为沃尔巴克氏体属（92.6%）。初步分析认为，5个地理种群小贯小绿叶蝉采样时间都在6月份，寄主植物主要是‘福鼎大白茶树品种，造成共生菌群落结构差异的原因可能与环境因素有关。

2.3 小贯小绿叶蝉成虫内共生细菌多样性分析

用Alpha Diversity对每个样本的多样性进行分析（表8），Chao指数和Ace指数反映样品中菌群的丰富度，Shannon指数反映菌群的多样性，Simpson指数反映菌群中优势种的集中程度。从丰富度指数看，赤壁样本最大，Chao指数、Ace指数分别为2 841.89和2 914.90；从多样性指数看，英山样本最大，Shannon指数8.63，其次为赤壁样本，Shannon指数7.93；从优势度指数看，英山样本最大，Simpson指数为0.99，咸安样本的Simpson指数最小。综合分析看，英山样本和赤壁样本相比其他样本，具有较高的多样性指数、丰富度指数和优势度指数，说明这两个样本中的细菌种类更丰富多样。

3 讨论

本研究采用16S rDNA V4高变区的高通量测序技术，对5个地理种群茶园小贯小绿叶蝉体内的细菌多样性及群落结构组成进行了研究。共注释鉴定获得41个门，116个纲，197个目，272个科，372个属，105个种。

在所鉴定获得的41个门中，变形菌门的细菌是5个样本共有的最主要的优势菌（60.6%～97.1%），这与许多昆虫肠道中的优势菌相同。如直翅目的沙漠蝗Schistocerca gregaria，半翅目的豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum，鳞翅目的茶尺蠖Ectropis obliqua、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis，鞘翅目的天牛Saperda vestita以及双翅目的地中海实蝇Bactrocera minax和泽兰实蝇Procecidochares utilis肠道优势菌均为变形菌门细菌[1016]。但是，5个样本优势菌的组成有所不同，其中咸安样本的优势菌相对简单，仅为变形菌门（97.1%）。而另外4个样本相对复杂，除了变形菌门以外，赤壁样本和英山样本的优势菌还有厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和酸杆菌门；大悟样本和武汉样本的优势菌还包括放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和蓝细菌门。

在属分类阶元，相对丰度排名前10的菌属中，盐单胞菌属（1.0%～27.1%）、希瓦氏菌属（0.5%～7.0%）和沃尔巴克氏体属（0.6%～92.6%）的细菌是5个样本共有的优势菌。不同样本的优势菌属差异明显，赤壁、大悟和英山样本最主要的优势属均为盐单胞菌属（23.8%、27.1%和8.8%）；武汉样本的优势属为泛菌属（61.2%）；而咸安样本的优势属为沃尔巴克氏体属，占比达92.6%。盐单胞菌是一类耐盐细菌，在盐湖、盐场、盐碱地、海冰和海洋极端环境中常有分布。最近研究发现，在核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei和桃蛀螟Dichocrocis punctiferalis幼虫肠道中都有盐单胞菌属存在[17]，但其生物学功能及对宿主昆虫的作用尚不清楚。5个地理种群小贯小绿叶蝉共有的优势菌沃尔巴克氏体菌Wolbachia，是一类广泛分布于节肢动物体内的共生菌，它不仅可以调节宿主的生殖活动，包括诱导细胞质不亲和、孤雌生殖和遗传上雌性雄性化等，还能改变宿主种群适合度，增强宿主抗逆性，如感染Wolbachia增加了黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊 Culex quinquefasciatus 对RNA病毒的抗性[18]。

本研究首次获得了不同茶园小贯小绿叶蝉地理种群成虫共生菌的相关信息，初步明确了不同地理种群共生菌的群落结构和优势菌群，为进一步研究共生菌与小贯小绿叶蝉之间的关系提供了基础信息。但这些优势菌群对宿主的生存、繁殖等生物学特性有哪些影响，还需要进一步深入研究。

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