葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

任芳 张尊平 范旭东 胡国君 李正男 董雅凤

摘要

葡萄病毒B Grapevine virus B （GVB）是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原，为开展抗GVB转基因研究，本研究利用RTPCR技术克隆GVB外壳蛋白（coat protein， CP）基因，与植物表达载体pRI 101AN连接构建植物表达载体pRIGVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRIGVB CP导入农杆菌LBA4404，并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B。共获得16个烟草再生株系，PCR检测其中3个株系为阳性，阳性株系播种获得的64株T1代植株中有30株扩增到目的条带，阳性率为46.9%，表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定，其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。

关键词

葡萄病毒B； 外壳蛋白基因； 植物表达载体； 烟草； 遗传转化

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017236

Construction of a plant expression vector of the Grapevine virus B

coat protein gene and transformation into Nicotiana tabacum

REN Fang， ZHANG Zunping， FAN Xudong， HU Guojun， LI Zhengnan， DONG Yafeng

（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Institute of Pomology，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xingcheng 125100， China）

Abstract

Grapevine virus B （GVB） is the pathogen of grapevine corky bark disease in the rugose wood complex. In order to develop transgenic plants resistant to GVB， the coat protein （CP） gene of GVB was cloned and inserted into the plant expression vector pRI 101AN and the recombinant plant expression vector pRIGVB CP was constructed. The vector pRIGVB CP was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 by electric shock process， and then introduced into Nicotiana occidentalis ‘37B by Agrobacteriummediated leaf disc transformation. Totally 16 regenerated tobacco strains were obtained in this study. PCR detection indicated that three stains were positive， and 46.9 percent of 64 T1 plants were positive by PCR detection， indicating that the target gene GVB cp was successfully introduced into the tobacco and successfully inherited to the progeny. The resistance of transgenic tobacco was identified by inoculating GVB into T1 transgenic plants. The results indicated that 6 out of 28 T1 transgenic plants showed resistance to GVB.

Key words

Grapevine virus B； coat protein gene； plant expression vector； tobacco； genetic transformation

葡萄Vitis vinifera L.是我國的重要水果之一，截至2015年其产量排名为我国水果产量的第四位[1]。但同时葡萄也是感染病毒种类最多的果树，目前国内外已报道65种病毒可侵染葡萄[2]，病毒病也逐渐成为制约我国葡萄产业化发展的重要因素之一。葡萄栓皮病（corky bark， CB）是皱木复合病（rugose wood complex， RW）中的一种病害类型[3]，其病原为葡萄病毒B Grapevine virus B（GVB），为线性病毒科Flexiviridae葡萄病毒属Vitivirus的重要成员[46]。目前GVB在美国、意大利[45]、法国、南非[6]、以色列[7]、印度[8]及中国[9]等全世界多个国家普遍发生，2014年对中国不同地区的188个葡萄样品检测发现其中17个样品携带GVB，带毒率为9%左右[9]。GVB感染葡萄后植株将终生带毒，难以通过化学药剂进行有效防治，因此培育抗病品种是防控葡萄病毒病的重要途径，利用基因工程导入外源基因是抗病育种的一种有效辅助手段。目前葡萄抗病毒基因工程主要利用病毒外壳蛋白（coat protein，CP）和移动蛋白（movement protein，MP）等病毒来源的基因作为抗性基因，并获得了抗病毒植株[1011]。这一类基因诱导植株产生针对来源病毒的特异抗性。田莉莉等[1213]为创制针对葡萄病毒的广谱抗病毒植物新材料，分别将2种和4种葡萄病毒部分cp基因片段串联构建RNAi干扰植物表达载体，分别转入烟草和葡萄体细胞胚，抗性效果有待进一步评价。除病毒源基因外，一些非病毒来源的基因也被应用于抗病毒基因工程，如郭佩佩等[14]利用大豆凝集素基因lecs转化烟草增强了植株对烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）的抗性；本实验室曾将一种广谱性抗病毒基因酵母pac1基因导入烟草，所获得的部分转基因植株对GVB表现出一定的耐病性，但并不能完全抵抗病毒的侵染[15]，因此还需探索和研究诱导抗性更强的外源基因。利用病毒cp基因培育抗病毒植株已有一些成功案例[1011]，但由于转基因葡萄植株培育、抗性评价等周期长、难度大，因此选择烟草等模式植物开展转基因研究，可快速获得转基因烟草植株并进行抗性评价，如RadianSade等[16]、Ling等[17]、JardakJamoussi等[18]将GVA 、GFLV、或GLRaV2等葡萄病毒cp或mp基因导入烟草获得转基因植株，通过摩擦接种转基因烟草观察症状表现快速进行抗性评价，初步筛选出抗病或耐病株系。有关GVB cp基因的遗传转化研究目前国内尚罕见报道，本实验室研究证明西方烟Nicotiana occidentalis‘37B接种GVB后，会出现明显褪绿、黄化、皱缩畸形等症状[15]，有助于快速进行抗病性评价，因此本研究将GVB cp基因作为目的基因导入该烟草，为评价其抗病毒效果、培育抗性更强的转基因植株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

用于GVB cp基因克隆的毒源为GVB带毒葡萄植株摩擦接种的西方烟N.occidentalis‘37B组培苗，由本实验室保存；用于遗传转化的健康西方烟‘37B组培苗由本实验室保存。

1.2 载体、菌株及主要试剂

大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态、农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404电击转化感受态、克隆载体pMD 19T、植物表达载体pRI 101AN、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR相关试剂等均购自TaKaRa公司（大连）；质粒提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；6苄氨基腺嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、萘乙酸（naphthylacetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indolebutyric acid，IBA）、鏈霉素（streptomycin，Sm）卡那霉素（kanamycin，Km）、头孢霉素（cefotaxime sodium，Cef）等激素和抗生素购自美国Sigma公司。

1.3 GVB cp基因的克隆

根据GenBank登录的GVB序列利用软件Primer premier 5.0及Oligo 6.0设计扩增GVB cp基因全长的引物：B8ABam（5′CAGGATCCTACGAGACAATAAGCAAGC3′），B8BSac（5′CCGAGCTCCACCCAAATACTTAGACATAC3′），上下游引物5′端分别添加Bam HⅠ和SacⅠ酶切位点。参照任芳等[19]的方法，从实验室保存的GVB毒源烟草组培苗中RTPCR扩增cp基因，连接到pMD 19T载体，转化DH5α 感受态，PCR筛选阳性克隆（pMDGVB CP）并进行测序和酶切验证。采用DNAStar 7.0和MEGA 7.0.14 软件进行序列分析和比对。多序列比较采用DNAstar Clustal V方法。

1.4 植物表达载体的构建及转化农杆菌

植物表达载体构建流程见图1，利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ分别对pMDGVB CP质粒和pRI 101AN载体双酶切，胶回收目的基因片段和线性化载体大片段，T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，PCR筛选阳性克隆（pRIGVB CP）并进行测序和酶切验证。提取pRIGVB CP质粒DNA，利用美国BIORAD公司Gene Pulser XcellTM电穿孔系统电击转化农杆菌LBA4404感受态。转化步骤：取20 μL感受态细胞置于冰上融化，加入2 μL质粒DNA；将混合液加入冰中预冷的BIORAD 电极间距0.1 cm的电击杯内，2 400 V电击2次；迅速置于冰上冷却，然后加入1 mL SOC培养基，30℃ 120 r/min振荡培养1 h；取适量菌液涂布于含卡那霉素（Km）100 mg/L和链霉素（Sm）100 mg/L的LB培养基，30℃培养48 h，挑斑培养，菌液PCR鉴定筛选阳性克隆。

1.5 烟草遗传转化及再生植株培育

参照任芳等[15]的叶盘法进行烟草遗传转化，将含重组质粒pRIGVB CP的农杆菌菌液振荡培养至OD600约为0.6时低速离心收集沉淀，沉淀用MS液体培养基重悬作为侵染源。将烟草无菌组培苗叶片剪成0.5～1.0 cm2的小块，在上述菌悬液中浸泡10 min，无菌滤纸吸干多余菌液，接种于分化培养基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+100 μmol/L乙酰丁香酮）上27℃暗培养3 d，然后转至含Km和Cef的选择培养基（MS+3.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Km+250 mg/L Cef）于（25±2）℃、L∥D=16 h∥8 h条件下培养，每月继代培养1次，诱导产生抗性芽，待不定芽长至1～2 cm时将其切下转到生根培养基（1/2MS+0.5 mg/L IBA+25 mg/L Km+150 mg/L Cef）诱导生根直至获得完整再生植株。

1.6 转基因植株PCR检测

取再生植株叶片采用CTAB法提取基因组DNA，提取步骤参照北京艾德莱生物科技有限公司CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书，采用引物B8ABam/B8BSac对DNA模板进行PCR检测，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。收集阳性T0代植株种子播种，培育T1代植株，同样采用引物B8ABam/B8BSac进行PCR检测鉴定阳性植株。

1.7 转基因植株抗病性初步鉴定

在转基因T1代阳性植株6叶期左右，取感染GVB的试管苗毒源摩擦接种转基因烟草，同时接种非转基因烟草为对照，观察转基因植株及对照植株症状表现，在接种后15 d和30 d分别采集植株叶片提取总RNA，采用引物GVBh/GVBc（GVBh：5′ATCAGCAAACACGCTTGAACCG3′，GVBc：5′GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC3′）进行RTPCR检测确定植株中带毒情况。

2 结果与分析

2.1 GVB cp基因的克隆

引物B8ABam/ B8BSac从实验室保存的毒源烟草中均扩增到约704 bp的目的片段（图2a）。克隆产物菌液PCR鉴定（图2b）和Bam HⅠ和SacⅠ双酶切鉴定（图2c）表明成功获得阳性克隆pMDGVB CP。阳性克隆经测序共获得11个GVB cp序列，包含完整GVB cp基因（594 bp）及两端引物和酶切位点序列。这些cp基因克隆序列相似性达98.8%～100%，与GenBank登录的GVB cp序列核苷酸相似性为77.9%～98.8%，其中与登录号X75448分离物相似性最高，达97.5%～98.5%，在进化树上也聚在一个分支。本研究所获得的11个克隆序列中仅有2个克隆序列共3个氨基酸差异，其余9个克隆均没有氨基酸突变，并且其中有6个克隆氨基酸和核苷酸序列均完全一致，表明这些序列为优势序列，选取其中的克隆991作为载体构建的目的片段。

2.2 植物表達载体pRIGVB CP构建及转化农杆菌

用BamHⅠ和SacⅠ分别对克隆质粒pMDGVB CP和载体pRI 101AN进行双酶切、回收和转化DH5α，克隆产物PCR扩增除1个克隆未扩增到目的条带外其余克隆均获得目的条带（图3a）。阳性克隆质粒DNA双酶切鉴定获得两条条带，其中小片段为cp基因，大片段为切下的载体片段（图3b）。阳性克隆测序结果显示未发生碱基突变，表明植物表达载体pRIGVB CP构建成功。将植物表达载体pRIGVB CP质粒DNA电击转化农杆菌LBA4404，克隆产物PCR扩增获得约704 bp的目的条带，表明载体成功转入农杆菌（图3c）。

2.3 烟草遗传转化及再生植株培育

含植物表达载体pRIGVB CP的农杆菌共浸润烟草叶盘（图4a），暗培养3 d后转入含Km和Cef的选择培养基上诱导培养，约4周后开始产生抗性不定芽（图4b）。待不定芽长至1～2 cm时切下不定芽转到生根培养基上诱导生根（图4c），成功获得完整再生植株（图4d）。在Km和Cef筛选下共获得再生烟草16株。

2.4 转基因烟草的PCR鉴定

采用引物B8ABam/ B8BSac对16株再生烟草植株的PCR鉴定结果表明，其中有3株扩增到约704 bp的目的条带，阴性对照和其余植株未扩增到目的条带（图5）。收集阳性T0代植株种子播种，对3个阳性株系共64株T1代植株进行PCR检测，其中30株扩增到目的条带，阳性率46.9%，表明目的基因GVB cp基因成功导入烟草并可成功遗传到子代植株。

2.5 转基因烟草抗病性初步鉴定

在转基因T1代阳性植株6叶期左右接种GVB毒源，共接种28株，同时接种10株非转基因烟草为对照。接种后15 d，所有非转基因植株新叶均出现褪绿、黄化、皱缩畸形及叶片变小等症状，接种的转基因T1代阳性植株中有22株出现与非转基因对照相似的症状，另外有6株未观察到明显症状（图6）。分别提取转基因T1代接种后无症状植株（6株）、转基因T1代接种发病植株（4株）、非转基因接种发病植株（4株）及非转基因未接种健康植株（2株）总RNA，采用引物GVBh/GVBc进行RTPCR检测。结果表明，转基因T1代接种发病植株和非转基因接种发病植株中均扩增到GVB目的条带，转基因T1代接种后无症状植株及非转基因未接种健康植株中均未扩增到GVB目的条带（图7）。接种后30 d再次采集相同植株叶片，RTPCR检测GVB带毒情况与接种15 d结果一致。因此，接种及检测表明无症状的6株转基因T1代植株中未被GVB侵染，初步表明其对GVB具有一定的抗性。

3 讨论

葡萄为多年生木本植物，生长周期长且再生困难，近年来与大田作物相比葡萄抗病毒基因工程进展相对缓慢。由于在葡萄上进行转基因植株培育、抗性评价等周期长、难度大，因此多项研究选择烟草等模式植物进行转基因植株培育和抗性评价[1618，20]。已有研究获得导入GVA cp、GFLV mp、GLRaV2 cp等葡萄病毒基因的转基因烟草，通过病毒接种及症状表现发现它们对同源病毒普遍具有抗性，抗性表现分为抗病（植株在整个试验期间均无症状）或耐病（植株发病延迟或症状减弱）等类型[1618]。本实验室此前获得的酵母pac1转基因烟草部分株系经病毒摩擦接种后也表现出症状延迟和减弱等耐病性，但仍可在植株体内检测到病毒存在，表明不能完全抵抗病毒侵染[15]。本研究成功构建了GVB cp基因植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化成功导入烟草获得转基因植株。但目前转化效率较低，阳性率仅为18%，可能与载体及菌株类型、受体材料状态及培养条件等原因有关。阳性株系播种获得的T1代植株中，阳性率达46.9%，表明目的基因可成功遗传子代，且通过T1代植株接种病毒进行抗病性鉴定表明，其中有6株对接种病毒GVB具有抗性，表明该转基因策略可成功获得抗性植株。在今后试验中将通过增加抗生素浓度及继代培养次数等途径提高转化率，并进行转基因植株扩繁培育以及葡萄遗传转化研究，为培育抗病毒植株、开展葡萄抗病毒分子辅助育种提供一定基础。

参考文献

[1] 周艳. 我国水果生产状况分析[J]. 南方农业， 2015， 9（30）： 146148.

[2] MARTELLI G P. Directory of virus and viruslike diseases of the grapevine and their agents [J]. Journal of Plant Pathology， 2014， 96 （S1）： 1136.

[3] MARTELLI G P. Rugose wood complex [M]∥MARTELLI G P. Grafttransmissible diseases of grapevines： Handbook for detection and diagnosis. Rome， Food and Agriculture Organization of the United Nations， 1993： 4554.

[4] BOSCIA D， SAVINO V， MINAFRA A， et al. Properties of a filamentous virus isolated from grapevines affected by corky bark [J]. Archives of Virology， 1993， 130： 109120.

[5] BOSCIA D， MINAFRA A， MARTELLI G P. Filamentous viruses of the grapevine： putative trichoviruses and capilloviruses[C]∥MONETTE P L. Filamentous viruses of woody plants. Trivandrum， India， Research Signpost， 1997： 1928.

[6] GOSZCZYNSKI D E. Divergent molecular variants of Grapevine virus B （GVB） from corky bark （CB）affected and CBnegative LN33 hybrid grapevines [J]. Virus Genes， 2010， 41： 273281.

[7] MOSKOVITZ Y， GOSZCZYNSKI D E， BIR L， et al. Sequencing and assembly of a fulllength infectious clone of Grapevine virus B and its infectivity on herbaceous plants [J]. Archives of Virology， 2008， 153： 323328.

[8] KUMAR S， SINGH L， FERRETTI L， et al. Evidence of Grapevine leafroll associated virus13， Grapevine fleck virus and Grapevine virus B occurring in Himachal Pradesh， India[J]. Indian Journal of Virology， 2013， 24（1）： 6669.

[9] HU G J， DONG Y F， ZHANG Z P， et al. Detection and sequence analysis of Grapevine virus B isolates from China[J]. Acta Virologica， 2014， 58： 180184.

[10]VALAT L， FUCHS M， BURRUS M. Transgenic grapevine rootstock clones expressing the coat protein or movement protein genes of Grapevine fanleaf virus： characterization and reaction to virus infection upon protoplast electroporation[J]. Plant Science， 2006， 170（4）： 739747.

[11]GAMBINO G， PERRONE I， CARRA A， et al. Transgene silencing in grapevines transformed with GFLV resistance genes： analysis of variable expression of transgene， siRNAs production and cytosine methylation [J]. Transgenic Research， 2010， 19（1）： 1727.

[12]田莉莉， 牛良. 葡萄抗病毒双价RNAi植物表达载体构建及其对烟草的遗传转化[J]. 果树学报， 2012， 29（6）： 9971003.

[13]田莉莉，牛良.葡萄广谱抗病毒RNAi载体构建及对合子胚起源的体细胞胚的遗传转化[J].分子植物育种，2016，14（1）：7279.

[14]郭佩佩，伍辉军，高学文.大豆凝集素基因lecs转化烟草增强对烟草花叶病毒的抗性[J].植物病理学报，2013，43（2）：157165.

[15]任芳， 董雅凤， 张尊平， 等. 酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性[J]. 植物保护学报， 2015， 42（4） ： 538543.

[16]RADIANSADE S， PERL A， EDELBAUM O， et al. Transgenic Nicotiana benthamiana and grapevine plants transformed with Grapevine virus A（GVA） sequences [J]. Phytoparasitica， 2000， 28（1）： 7996.

[17]LING Kaishu， ZHU Haiying， GONSALVES D. Resistance to Grapevine leafroll associated virus2 is conferred by posttranscriptional gene silencing in transgenic Nicotiana benthamiana[J]. Transgenic Research， 2008， 17（4）： 733740.

[18]JARDAKJAMOUSSI R， WINTERHAGEN P， BOUAMAMA B， et al. Development and evaluation of a GFLV inverted repeat construct for genetic transformation of grapevine [J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2009，97（2）：187196.

[19]任芳， 范旭東， 董雅凤， 等. 葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异分析[J]. 分子植物育种， 2012， 10（5）： 568574.

[20]任芳， 董雅凤， 张尊平， 等. 葡萄抗病毒转基因研究进展[J]. 园艺学报， 2013， 40（9）： 16331644.

（责任编辑：田 喆）