抗苄嘧磺隆野慈姑乙酰乳酸合成酶的突变研究

付丹妮　赵铂锤　孙中华　纪明山

摘要

近年来，野慈姑Sagittaria trifolia L.在中国东北稻区发生和危害日趋严重，部分稻区使用苄嘧磺隆已无法有效防除该杂草。为了明确野慈姑抗药性发生的根本原因，本试验从分子水平上对野慈姑抗苄嘧磺隆的机理进行了研究。通过对抗药性（H4）和敏感性（S）野慈姑种群靶标酶乙酰乳酸合成酶（ALS）基因片段进行扩增和克隆，比较其DNA序列的差异，确定导致抗药性产生的ALS氨基酸突变位点。结果表明，与敏感性野慈姑ALS基因相比，H4种群第197位脯氨酸（Pro）突变为苏氨酸（Thr），该位点的突变可能是H4野慈姑种群对苄嘧磺隆产生抗药性的主要原因。ALS第197位Pro突变为Thr致使对苄嘧磺隆产生抗药性是第一次在野慈姑种群中报道。

关键词

水稻田； 野慈姑； 靶标抗药性

中图分类号：

S 481.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017232

Mutation in acetolactate synthase of Sagittaria trifolia resistant tobensulfuronmethyl

FU Danni， ZHAO Bochui， SUN Zhonghua， JI Mingshan

（College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract

In recent years， Sagittaria trifolia L. has been a serious problem in paddy fields in northeast of China. It is very difficult to control by bensulfuronmethyl in some areas. The objective of this study is to understand the molecular mechanism of the resistance to bensulfuronmethyl in S.trifolia and to find the specific mutation sites in amino acid sequence of acetolactate synthase （ALS） in the resistant S.trifolia populations.Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from susceptible （S） and resistant （H4） S.trifolia populations to bensulfuronmethyl， respectively， and sequenced subsequently.Sequence analysis showed that H4 population had a mutation at position 197（Pro）. The mutation was Pro197Thr，which may be responsible for the resistance to bensulfuronmethyl in the S.trifolia population.Pro197Thr mutation conferring resistance to bensulfuronmethyl is reported for the first time in S.trifolia.

Key words

paddy field； Sagittaria trifolia； targetsite resistance （TSR）

野慈姑Sagittaria trifolia L.，澤泻科慈姑属多年生水生或沼生草本植物，主要分布于热带以及亚洲的温带地区[1]，是水稻田常见的阔叶杂草之一，以球茎进行营养繁殖为主。苄嘧磺隆（bensulfuronmethyl）属磺酰脲类除草剂，通过抑制植物体内的乙酰乳酸合成酶ALS酶活性，阻止支链氨基酸的合成，从而导致植物蛋白质合成受损，最终杀死植物[23]。自20世纪80年代中后期，由于苄嘧磺隆具有活性高、选择性强、毒性低等特点，在我国东北水稻产区开始广泛使用，使野慈姑得到了有效防治。而由于苄嘧磺隆作用位点单一和大量连续使用，导致了抗苄嘧磺隆的野慈姑大量出现。2000年前后，苄嘧磺隆对野慈姑的防效明显下降，野慈姑的发生和危害日趋严重[4]，相继在吉林省[5]和辽宁省[6]发现了抗磺酰脲类除草剂的野慈姑种群。

在大多数情况下，杂草对ALS抑制剂产生抗药性是由ALS基因一个或几个位点突变所引起[7]。目前，在抗ALS抑制剂的杂草中，靶标酶上已发现有8个突变位点（Alal22，Prol97，Ala205，Asp376，Arg377，Trp574，Ser653，Gly654）发生28种氨基酸替换，其中任何一个位点发生突变，均可大幅度降低除草剂品种与杂草靶标的亲和力[810]。Guttieri等[11]在1992年报道了毒莴苣Lactuca seriola和地肤Kochia scoparia对ALS抑制剂的抗性是由197位脯氨酸突变所引起，首次从分子水平上研究了杂草抗药性机理。随着研究技术的发展，更多杂草的ALS基因被克隆、测序、分析，抗药性机理得到更好的解释。

我国东北地区使用苄嘧磺隆防治水稻田杂草具有较早的历史，根据田间调查和农民的反映，大多数稻田的野慈姑已经对苄嘧磺隆产生了抗药性。研究野慈姑对苄嘧磺隆的抗药性问题，对抗药性野慈姑的治理以及指导农民正确使用除草剂具有重要意义。本研究从分子水平上确定野慈姑对苄嘧磺隆的抗药性是由于ALS基因突变所引起，并初步明确其产生抗药性突变的基因位点。为延缓野慈姑抗药性种群的发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

抗药性野慈姑球茎（H4）于2015年5月采自黑龙江省双鸭山市宝清县方盛村多年连续使用磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆的稻田，野慈姑已对苄嘧磺隆产生抗药性。将采集的球茎种植于无孔的塑料花盆内（23 cm×15 cm），置于室外正常水分管理，待其長至2～3叶期用30%苄嘧磺隆可湿性粉剂（上海杜邦农化有限公司）120 g/hm2茎叶喷雾处理，处理后存活的植株继续培养。

对照敏感性野慈姑幼苗（S）于2015年6月采自辽宁省沈阳市棋盘山风景区远离稻田的湖边（未使用过除草剂）。将采集的幼苗种植于无孔的塑料花盆内（23 cm×15 cm），置于室外正常水分管理。随机挑选20株用30%苄嘧磺隆可湿性粉剂30 g/hm2茎叶喷雾处理，21 d后全部死亡，未处理植株继续培养。2015年11月上旬从花盆中挖出抗药性和敏感性球茎分别保存于4℃冰箱中，待用。

取冰箱中保存的大小一致的抗药性（H4）和敏感性（S）野慈姑球茎分别放置于装有清水的培养皿中，在28℃光照培养箱内催芽3 d后，每盆3个球茎，分别种植于无孔的塑料盆内（23 cm×15 cm）。种植深度3 cm，保持水层3～5 cm。试验用土为未使用过除草剂的稻田土。放置于温室中，生长条件为白天（25±5）℃，夜间（14±5）℃。待植株长至3～4叶期，取幼嫩叶片，放入-80℃冰箱中保存，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 野慈姑DNA的提取

用Tiangen生化科技（北京）有限公司的DNAsecure Plant Kit提取抗药性（H4）和敏感性（S）野慈姑的DNA，各取10个叶片进行提取。用紫外分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。用OD260/OD280衡量DNA纯度，比值大于1.9，表明有RNA污染；小于1.6，表明有蛋白质、酚等污染。

1.2.2 野慈姑ALS基因片段的扩增和克隆

用表1所列两对引物分别扩增H4和S野慈姑DNA，产物包含已报道的8个突变位点。25 μL的PCR反应体系中包括：叶片总DNA（60 ng/μL）1.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，2×Es TaqMasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性4 min，然后94℃变性30 s，在每个引物的最佳退火温度下退火30 s（表1），72℃延伸90 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。

PCR反应结束后，取5 μL产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。采用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，将回收片段与pUCT载体连接，然后转到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，均匀涂布于含有Xgal/IPTG的氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上培养过夜，选择白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基，振荡培养过夜，用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒。对重组质粒按上述PCR条件进行扩增，并进行电泳检测，出现目的片段的为阳性克隆。

1.2.3 测序及序列分析

阳性克隆的序列测定采用美国ABI公司的3730XL测序仪和双脱氧链终止法进行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。每个种群选取10株单个植株用做突变检测，每个片段测序5个阳性克隆。将测序的序列进行BLASTx比对，然后用DNAMAN 8.0对抗药性和敏感性野慈姑ALS基因片段序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 ALS基因片段的扩增与克隆

提取的野慈姑H4和S种群的DNA经紫外分光光度计检测，OD260/OD280在1.7～1.9范围内，表明DNA的纯度达到了要求。用两对引物扩增野慈姑不同种群的DNA，分别得到大约920 bp和730 bp的片段（图1）。对PCR产物进行切胶回收后的产物与pUCT载体连接、转化，对重组的质粒进行PCR鉴定，获得的片段与最初的两个PCR产物大小相同。

2.2 ALS基因片段测定结果

用DNAMAN 8.0将测序后的两段序列拼接，得到的序列总长度为1 634 bp，编码547个氨基酸，在NCBI中进行BLAST，与已经登记的野慈姑ALS基因序列同源性达到99%，证明扩增得到的野慈姑ALS基因序列是正确的。这段序列中不存在内含子，并且包含了在其他杂草中已经报道的8个氨基酸突变位点。将得到的抗药性和敏感性野慈姑ALS基因片段和拟南芥ALS基因片段用DNAMAN 8.0进行对比，结果（表2）显示，与敏感性野慈姑种群S相比，抗药性种群H4在第197位脯氨酸都发生了突变，此位点由CCC突变成ACC（图2），编码苏氨酸（Thr），所测得的10个植株在Pro197位都有相同的突变，在已经报道的Ala122、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654位点均没有产生突变。

3 结论与讨论

目前，被研制开发出来的不同结构的ALS抑制剂类除草剂最主要有五大类，即磺酰脲类（sulfonylurea， SU）、咪唑啉酮类（imidazolinone， IMI）、嘧啶硫代苯甲酸酯类（pyrimidinylthiobenzoate， PTB）、三唑并嘧啶类（triazolopyrimidine， TP）和磺酰胺羰基三唑啉酮类（sulfonylaminocarbonyltriazolinone， SCT），其中磺酰脲类、三唑并嘧啶类和咪唑啉酮类品种多，被广泛推广和应用[1215]。由于该类除草剂作用位点单一和大量的重复使用，抗该类除草剂杂草大量出现[16]。截至目前，世界各地已有159种杂草对ALS抑制剂类除草剂产生了抗药性[17]。

国内外有关野慈姑对ALS抑制剂类除草剂抗性机制的研究主要集中在高水平抗性的靶标位点突变上。Iwakami等[18]研究发现，日本秋田县野慈姑R1和R2两个种群对磺酰脲类除草剂产生了抗药性，R1和R2对苄嘧磺隆及R1对吡嘧磺隆均表现高抗，其中抗药性野慈姑种群R1与敏感性种群S1相比，ALS基因第197位氨基酸由脯氨酸（CCC）突变为丝氨酸（TCC），属于靶标抗药性（targetsite resistance， TSR）。Wei等[6]测定了东北地区两个水稻田野慈姑种群对苄嘧磺隆的抗药性水平，并通过与敏感种群ALS基因序列进行比较，确定ALS基因Pro197Leu和Pro197Ser突变引起抗药性野慈姑ALS对该药剂的敏感性降低，是引起其产生抗药性的原因。

本研究通过对抗药性及敏感性野慈姑ALS基因进行扩增、测序和对比后发现，抗药性H4野慈姑种群的ALS基因第197位脯氨酸（Pro）被苏氨酸（Thr）取代，这是第一次在野慈姑种群中被发现。ALS基因Pro197Thr取代导致杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗药性在前人的研究中已得到证实。例如： 野萝卜Raphanus raphanistrum L.、萤蔺Scirpus juncoides （Roxb.）、播娘蒿Descurainia sophia L.和看麦娘Alopecurus aequalis Sobol.等，该突变是其对磺酰脲类除草剂产生抗药性的分子基础[1922]。因此，Pro197Thr是导致H4野慈姑种群对苄嘧磺隆产生抗药性的重要原因之一。

参考文献

[1] 汪小凡，陈家宽. 野慈姑自然群体异交率的定量估测[J].遗传， 2000， 22（5）： 316318.

[2] DUGGLEBY R G， MCCOURT J A， GUDDAT L W. Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase [J].Plant Physiology and Biochemistry， 2008， 46（3）： 309324.

[3] DUGGLEBY R G， PANG S S.Acetohydroxyacid synthase [J].BMB Reports， 2000， 33（1）： 136.

[4] 陈丽丽，何付丽，范丹丹，等.黑龙江省野慈姑对吡嘧磺隆的敏感性测定[J].植物保护，2013，39（6）：120123.

[5] 吴明根，曹凤秋，杜小军，等.延边地区稻田抗药性杂草的研究[J].杂草科学，2005（1）：1415.

[6] WEI Songhong， LI Pingsheng， JI Mingshan， et al. Targetsite resistance to bensulfuronmethyl in Sagittaria trifolia L. populations[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2015， 124： 8185.

[7] 張朝贤， 倪汉文， 魏守辉， 等. 杂草抗药性研究进展[J]. 中国农业科学， 2009， 42（4）： 12741289.

[8] CUI Hailan， ZHANG Chaoxian， ZHANG Hongjun， et al. Confirmation of flixweed （Descurainia sophia） resistance to tribenuron in China [J]. Weed Science， 2008， 56（6）： 775779.

[9] YU Q， POWLES S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides： current understanding[J]. Pest Management Science， 2014， 70（9）： 13401350.

[10]VARANASI V K， GODAR A S， PETERSON D E，et al. A targetsite point mutation in henbit （Lamium amplexicaule） confers highlevel resistance to ALSinhibitors[J]. Weed Science， 2016， 64（2）： 231239.

[11]GUTTIERI M J， EBERLEIN C V， THILL D C. Diverse mutations in the acetolactate synthase gene confer chlorsulfuron resistance in kochia （Kochia scoparia） biotypes [J].Weed Science，1995，43（2）：175178.

[12]CHALEFF R S， MAUVAIS C J.Acetolactate synthase is the site of action of two sulfonylurea herbicides in higher plants[J]. Science， 1984， 224： 14431446.

[13]SHANER D L， ANDERSON P C， STIDHAM M A.Imidazolinones： Potent inhibitors of acetohydroxydacid synthase[J]. Plant Physiology，1984， 76（2）： 545546.

[14]GERWICK B C， Subramanian M V， LoneyGallant V I， et al. Mechanism of action of the 1，2， 4triazolo [1， 5α] pyrimidines[J]. Pest Management Science， 1990， 29（3）： 357364.

[15]STIDHAM M A. Herbicides that inhibit acetohydroxyacid synthase [J]. Weed Science， 1991， 39（3）： 428434.

[16]卢宗志， 张朝贤， 傅俊范， 等. 抗苄嘧磺隆雨久花ALS基因突变研究[J]. 中国农业科学， 2009， 42（10）： 35163521.