地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

徐龙　黄文祥　刘红霞

摘要

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果，为挖掘其生防功能基因，本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化，建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为：转接培养10 h达到对数生长后期的菌体，浓缩4倍后，利用终浓度1 mg/mL的溶菌酶，于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解效率达到99.34%，1×SMM洗涤3次，调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL，并通过1.6 kV、5 ms的电击后，迅速在SMMP溶液中100 r/min、37℃恢复6～10 h，涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA（8 253 bp）和基因敲除质粒pMADΔCP（13 043 bp）的大片段质粒转化，分别获得了37 cfu/μg DNA和10 cfu/μg DNA 阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。

关键词

地衣芽胞杆菌； 原生质体； 电转化； 质粒

中图分类号：

Q 785

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017301

Studies on the electroporation system for Bacillus licheniformis

HS10 protoplast

XU Long， HUANG Wenxiang， LIU Hongxia

（College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Bacillus licheniformis HS10 and its crude protein have good effects on various pathogenic fungi. In order to identify the functional genes， genetic manipulation is needed. Though the optimization of the protoplast preparation， regeneration medium， osmotic stabilizer， shock conditions and other experimental conditions， the electroporation method of protoplast was set up in this paper. The experimental results showed that the optimum reaction conditions were as followed： The cells at logarithmic growth period after transferred for 10 h were concentrated by 4 times， and then subjected to enzymolysis for 20 min with a final concentration of 1 mg/mL lysozyme at 37℃ and 150 r/min. Enzymolysis rate reached 99.34%. The products of enzymolysis were washed for three times with 1× SMM and adjusting the concentration to 1.0×108 cfu/mL. After electroporation at 1.6 kV and 5 ms， with 0.5 mol/L sucrose as osmotic stabilizer， the cells were quickly restored for 6-10 h in SMMP solution， then coated on DM3 resistant plate. In the largefragment transformation using the plasmids pMarA （8 253 bp） and pMADΔCP（13 043 bp）， we obtained 37 cfu/μg DNA and 10 cfu/μg DNA positive transformants. This study established a genetic transformation system for the genetic manipulation of Bacillus licheniformis HS10.

Key words

Bacillus licheniformis； protoplast； electroporation； plasmid

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis具有完善的蛋白表达系统、丰富的代谢产物以及对多种病原微生物具有拮抗能力的优势，被广泛应用于病害生物防治、蛋白酶工业、工业发酵领域[12]。已有研究表明：地衣芽胞杆菌对农作物的真菌性病害，如灰霉病[3]、油菜菌核病[4]、柑橘炭疽病及苹果轮纹病[5]等有较好的防治效果。因此，地衣芽胞杆菌是最具应用开发潜力的芽胞杆菌之一。

Bacillus licheniformis HS10分离于黄瓜根际，对黄瓜霜霉病的田间防效达到40%～60%，Wang等发现该菌株及其蛋白粗提取物对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、小麦根腐病菌Bipolaris sorokiniana等多种病原真菌均具有拮抗作用，通过对其粗蛋白进行纯化分析和GCMS鉴定，发现起拮抗作用的是类羧肽酶蛋白[6]。为深入探究该菌株防病抑菌机理，挖掘功能基因，需要对菌株进行基因水平的遗传操作。

野生地衣芽胞杆菌转化技术多借鉴枯草芽胞杆菌，已报道的转化方法主要有原生质转化法[7]和电转化法[8]。但由于感受态形成缺陷、限制性修饰系统、菌株差异等特性，使得菌株转化较为困难[910]。我们前期试验中尝试了化学转化、电转化、原生质转化法，以及温赛等[11]提出的原生质电转化法，均未获得阳性转化子。

针对该问题，本研究利用正交试验优化了原生质体制备中各影响因素，分析确定了最适酶解条件，并针对原生质体的渗透压稳定剂、恢复条件、电击条件等因素进行了摸索，实现了用于突变体库构建的pMarA（8 253 bp）质粒和用于基因敲除的pMADΔCP （13 043 bp）大片段重组质粒的转化。建立了地衣芽胞杆菌HS10转化体系，为后续深入机理探究、工程菌株构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Bacillus licheniformis HS10、DH5α为本实验室保存。pMarA质粒为高学文教授课题组馈赠。pMAD载体[12]为本实验室保存，pMADΔCP为本实验室构建的，用于HS10中类羧肽酶基因的敲除质粒。

1.1.2 试剂

溶菌酶（lysozyme）购于Sigma公司。取1 g用菌体保护液SMMP溶解，定容至10 mL，配制成100 mg/mL，并使用0.22 μm滤器除菌，-20℃分装保存。卡那霉素（Kan）和红霉素（Erm）购于南京鼎思生物科技公司。卡那霉素用ddH2O溶解配制成50 mg/mL，过0.22 μm滤器除菌；红霉素用无水乙醇溶解配制成5 mg/mL，过0.22 μm滤器除菌。

LB：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L NaCl，pH 7.2，15 g/L琼脂；SOB培养基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，0.5 g/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2；SOC培养基：SOB中添加20 mmol/L葡萄糖。

4×PAB：6 g/L牛肉膏，6 g/L酵母浸粉，20 g/L胰蛋白胨，19.3 g/L K2HPO4·3H2O，5.3 g/L KH2PO4，14 g/L NaCl，120℃灭菌，加50%葡萄糖8 mL。

2×SMM：4.6 g/L马来酸（顺丁烯二酸），8.1 g/L MgCl2·6H2O，pH 6.5，灭菌后加入终浓度为1 mol/L蔗糖。1×SMM：2×SMM与dd H2O等体积混匀。

菌体保护液SMMP：4×PAB与2×SMM等体积混合后加入2%BSA（注：2×SMM含有1 mol/L蔗糖，因此SMMP中蔗糖终浓度为0.5 mol/L，即以0.5 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂）；其他菌体保护液：分别用终浓度为0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇、10%甘油、0.5 mol/L海藻糖、1 mol/L琥珀酸钠、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖或0.75 mol/L甘露醇代替0.5 mol/L的蔗糖作为SMMP的渗透压稳定剂，其他组分不变，配制成含不同稳定剂的菌体保护液。

DM3再生培养基：5 g/L水解酪蛋白，1.5 g/L KH2PO4，4.6 g/L K2PO4·3H2O，162.05 g/L琥珀酸钠，10 g/L淀粉，5 g/L酵母浸粉，8 g/L琼脂，5 g/L葡萄糖，0.09 g/L BSA，0.02 mol/L MgCl2，（葡萄糖、MgCl2單独灭菌后加入）；RD再生培养基：1 g/L （NH4）NO3，3.5 g/L K2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，81 g/L琥珀酸钠，5 g/L明胶，4.07 g/L MgCl2·6H2O，5 g/L葡萄糖，8 g/L琼脂。

1.2 方法

1.2.1 菌体生长曲线的测定

使用LB平板活化超低温保存的地衣芽胞杆菌HS10，于37℃培养1 d，挑取单菌落接种于含LB试管中，37℃、200 r/min培养12 h后，按1%接种量转接至100 mL LB中（250 mL三角瓶）继续培养，每小时取样，检测培养物OD600，记录分析。

1.2.2 HS10原生质体的制备

挑取转接培养4、6、8、10 h的菌体，离心收集菌体并用1/4体积SMMP重悬，使用终浓度1 mg/mL的溶菌酶于37℃处理20 min，获得原生质化的HS10菌体。酶解后直接稀释涂布LB平板计数，以未酶解处理的对照作总菌量。

原生质体形成率=[1-（酶解后菌量/总菌量）]×100%。

1.2.3 HS10原生质体的再生与恢复

由上述方法制备的原生质体，使用含有0.5 mol/L蔗糖的SMMP恢复培养4 h，涂布相应平板，检测各渗透压稳定剂下菌体恢复情况。

1.2.4 HS10原生质体的电转化与恢复

将制备好的原生质体于4℃，5 000 r/min离心10 min，使用预冷的1×SMM溶液反复漂洗3次，之后使用1×SMM重悬，调整菌浓度为1.0×108cfu/mL。将原生质体以100 μL分装，电击前加入4 μL 250 ng/μL pMarA质粒混匀（即1 μg质粒），置于冰上5 min后，使用预冷的2 mm电击杯，设置1.6～2.5 kV，5 ms，进行电击转化，电击后迅速加入1 mL预冷的SMMP恢复培养液，于37℃，100 r/min培养6～10 h后，涂布于含卡那霉素Kan （10 mg/mL）和红霉素Erm（5 mg/mL）的固体DM3培养基上。每个试验重复3次。（电击仪使用Eppendorf的Multiporator多功能细胞电穿孔仪，电阻为系统设定值）。

1.2.5 质粒的提取和细菌基因组DNA提取

菌体质粒的提取参照AxyPrep小量质粒提取试剂盒APMNP250的使用说明。地衣芽胞杆菌基因组DNA提取参照Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒DP30202的使用说明。

1.2.6 阳性转化子的验证

利用pMarA构建地衣芽胞杆菌HS10随机突变体库的方法，以及阳性转化子的验证所使用的引物oTNP1和oTNP2参考Le Breton等[13]，引物kanF和kanR为本实验室设计。

转化子的PCR验证参考TaKaRa的rTaq酶产品说明，程序为95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 10 min。酶切验证参考TaKaRa限制性内切酶产品说明。

1.2.7 试验统计分析

数据使用DPS 7.05软件进行单因素方差分析，LSD法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线的测定

不同菌龄的菌体其生长状态、胞内外合成物质、对外界条件的敏感性均存在差异。对HS10进行生长曲线测定（图1），可以看到：当按1%菌量，37℃、200 r/min转接培养4 h后，菌体开始进入对数生长期，10 h后达到对数生长后期，之后进入稳定期。

2.2 HS10原生质体制备最佳条件正交试验

对不同试验条件下原生质体的形成情况进行分析，结果表明，地衣芽胞杆菌原生质体制备过程中最为重要的影响因素是溶菌酶浓度。在0.1 mg/mL的浓度下，原生质体的形成率，即酶解效率多为80%以下，而1 mg/mL浓度下能达到95%以上，但随着溶菌酶浓度的继续增加，原生质体的形成率并没有明显差异（表2）。同时，原生质体的形成率随着菌龄的增加而增加，表明随着菌体的成熟，其对溶菌酶也越来越敏感。为保证获得足够多的原生质体，又不至于由于使用过高的溶菌酶浓度和酶解时间导致菌体的再生恢复能力降低，并考虑到后续试验中菌量和渗透压稳定剂等因素，最终选择HS10最佳酶解条件为：转接培养10 h，将菌体浓缩4倍后，使用1 mg/mL终浓度的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，以此获得最佳原生质体。

2.3 HS10原生质体最佳恢复条件

进一步分析渗透压稳定剂对原生质体再生的影响可知，按上述优化的酶解条件，酶解并恢复4 h后，以0.5 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂，恢复的菌体量最大，能够达到8.5×107cfu/mL，随后依次是0.5 mol/L甘露醇（7.4×107 cfu/mL）、10%甘油（6.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L山梨醇（6.7×107 cfu/mL）、0.5 mol/L海藻糖（6.2×107 cfu/mL）、1 mol/L琥珀酸鈉（5.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖（4.0×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇（2.9×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖（1.7×107 cfu/mL）、0.75 mol/L甘露醇（1.5×107 cfu/mL）（图2）。

由试验结果可以看出，过高浓度渗透压稳定剂并不有利于菌体的恢复再生，再生的菌量甚至低于SMMP（H2O）条件，同时可以看出，在无渗透压稳定剂的条件下，依然有大量的菌体恢复扩增，甚至优于过高渗透压条件。故在后续的电击试验和菌体恢复中，采用0.5 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂。

将SMMP溶液中恢复的菌体稀释涂布于不同的培养基中，可以看出：DM3由于其营养丰富，最有利于菌体细胞壁的再生和恢复，而LB、SOB、SOC培养基并不是最佳选择（图3）。同时相较于RD培养基，DM3中菌体的恢复量高于RD再生培养基，菌体在平板上生长也更加圆润和健康，因此选择DM3作为再生培养基。

2.4 电击强度对HS10原生质体转化的影响

本研究采用瞬间电击实现原生质体的转化，此过程对原生质体的伤害会影响原生质体的恢复再生，过低的电压无法产生合适的穿孔，而过高的电压又会导致菌体大量死亡。由图4可以看出，原生质体在电击并恢复4 h后，恢复的菌量随电击强度的增强而减少，菌量依次为：1.6 kV时1.9×107 cfu/mL、2.0 kV时1.0×107 cfu/mL、2.5 kV时7.0×106 cfu/mL。原生质体对电击强度较敏感，原生质体受到的伤害随着电击强度增加而增加。因此选择较低的1.6 kV的电压更为合适。

电压优化试验显示，原生质体在不同电压条件下获得的转化子数分别为：0.8 kV时7 cfu/μg DNA、1.2 kV时21 cfu/μg DNA、1.6 kV时37 cfu/μg DNA、2.0 kV时18 cfu/μg DNA、2.5 kV时9 cfu/μg DNA（图5）。原生质体在1.6 kV电压条件下获得转化子数最多。1.6 kV以下，电压与转化效率呈正比，1.6 kV以上呈反比。可能原因为过强的电压条件会导致部分菌体受伤严重，无法进行菌体细胞壁再生恢复，或菌体恢复较慢，导致在涂布抗生素平板后，菌体无法生长。由此可知最佳的电击条件为1.6 kV，5 ms。

2.5 质粒大小对HS10原生质体转化的影响

在此之后，又对该菌株进行了更大质粒的电击转化。转化质粒为pMADΔCP，质粒大小为13 043 bp。结果显示质粒大小对转化效率有一定影响，pMADΔCP质粒转化子显著少于pMarA质粒（表3）。

2.6 阳性转化子的验证

将穿梭载体pMarA、pMADΔCP转化入HS10中，挑取转化子提取质粒，对质粒进行PCR和酶切验证。结果如图6所示：用Kpn I分别对pMarA和HS10pMarA质粒酶切后，都形成了2个大小为1.5 kb和6.5 kb的片段，PCR扩增pMarA和HS10pMarA质粒中的Himar 1转座酶基因，都得到长度为1.5 kb的片段，扩增TnYLB1中的Kan基因，都形成了370 bp的片段。在对pMADΔCP质粒的检测中，使用BgI II/Nco I双酶切，均能产生3 600 bp的片段。上述结果表明：pMarA、pMADΔCP质粒已成功转入地衣芽胞杆菌HS10菌株中。

提取突變体菌株的基因组，扩增转座子TnYLB1中的Kan片段，由图7可以看出，随机挑选的15个突变体基因组中均含有370 bp大小的片段，证实TnYLB1成功插入到HS10基因组中。

3 讨论

地衣芽胞杆菌已报道的转化方法主要有“原生质转化法”和“高渗透电转化法”[78]。聚乙二醇介导的原生质转化法的原理是聚乙二醇能够黏合细胞、扰乱细胞膜双分子层，并能够吸附溶液中的水分子使外源DNA和细胞膜形成分子桥，促进相互之间的接触连接，从而导入外源DNA实现转化[1415]。高渗透电转化法则是利用瞬间电压实现电穿孔，从而利于外源质粒导入菌体。前者反应较为温和，后者存在细胞壁阻碍，在二者均无法成功转化时可选择原生质体电转化法，在打破细胞壁阻碍的同时，利用电穿孔增加外源DNA导入菌体的机会，使得转化更为高效可行。但该法较为繁琐，需要对原生质体的制备、电击条件、原生质体的恢复再生等条件进行优化才能达到最佳的转化效率[10]。

在原生质体制备中，除菌体生长状态外，溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度也是重要影响因素[7]。溶菌酶浓度过高、时间太长均会导致脱壁太彻底，不利于菌体的再生恢复，而溶菌酶浓度过低、时间太短，又会因酶解不彻底而影响转化。温赛等对影响酶解的条件进行了单因素逐一分析[10]，本论文选用4因素4水平的正交试验进行原生质体制备的优化，并得出最佳条件为：取对数生长后期菌体，浓缩4倍后使用终浓度1 mg/mL的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解率达到99.34%。优化后的条件及研究方法对其他野生地衣芽胞杆菌原生质体的制备具有参考价值。

电击后的恢复培养是受伤的菌体恢复再生的重要时期，酶解液、电击缓冲液、恢复培养液均需使用合适的渗透压稳定剂，以维持受损细胞的形态，避免吸水胀破。Junichi等报道称，无机盐作为渗透压更有利于原生质体的形成，但糖醇类物质更有利于原生质体的再生[1617]。试验得出0.5 mol/L蔗糖最有利于HS10菌体的恢复，0.5 mol/L甘露醇仅次于0.5 mol/L的蔗糖。需要指出的是：该结果不能等同于原生质在不同渗透压稳定剂下的恢复率，因为原生质体在4 h的恢复过程中，存在菌体的扩增，包括未原生质化菌体和再生菌体的扩增。在电压条件优化方面，选择1.6 kV，5 ms进行电转化能降低对菌体的伤害，又能保证较高的转化效率。优化的渗透压稳定剂和电转化条件对其他野生地衣芽胞杆菌的转化具有借鉴意义。不足之处在于，只对pMarA质粒的转化进行了电压摸索和优化，未能在更大片段的pMADΔCP（13 043 bp）质粒的转化中进一步优化电压。

在对不同野生菌株进行转化时，会因为各种原因导致转化失败，例如：原生质体制备不佳、渗透压稳定剂不合适、电转电压过高导致死亡、电压过低无法形成很好的穿孔、菌体恢复时间过短、菌体洗涤不干净导致击穿、菌浓度过高导致电击效率不佳，甚至操作时间过长等。因此，在实际操作中，应视情况做相应的调整。综上，本试验通过对野生地衣芽胞杆菌HS10原生质体制备、电转化、恢复等过程进行了优化，成功实现了高效率的转化，为后续地衣芽胞杆菌HS10基因改造、防病机理的探究等打下基础。

参考文献

[1] 牛丹丹， 石贵阳， 王正祥. 分泌高效蛋白的地衣芽胞杆菌及其工业应用[J]. 生物技术通报， 2009（6）：4550.

[2] 孙倩， 陈复生， 丁长河， 等. 地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化[J]. 食品工业科技， 2012，33（13）：174177.

[3] 童蕴慧， 郭桂萍， 徐敬友， 等. 拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导[J]. 中国生物防治， 2004（3）：187189.

[4] 孙启利， 陈夕军， 童蕴慧， 等. 地衣芽胞杆菌W10抗菌蛋白对油菜菌核病菌的抑制作用及防病效果[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版）， 2007（3）：8286.

[5] 纪兆林，童蕴慧，凌筝，等.拮抗细菌对部分水果产后病原真菌的抑制及防腐作用[J].金陵科技学院学报，2003（4）：2327.

[6] WANG Z， WANG Y， ZHENG L， et al. Isolation and characterization of an antifungal protein from Bacillus licheniformis HS10 [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014，454（1）：4852.

[7] 莫静燕， 陈献忠， 王正祥. 地衣芽胞杆菌原生质体的制备、再生及转化研究[J]. 生物技术， 2009，19（5）：7577.

[8] ROMERO D， PEREZGARCIA A， VEENING J W， et al. Transformation of undomesticated strains of Bacillus subtilis by protoplast electroporation[J]. Journal of Microbiological Methods， 2006，66（3）：556559.

[9] SUGA M， KUSANAGI I， HATAKEYAMA T. High osmotic stress improves electrotransformation efficiency of fission yeast [J].FEMS Microbiology Letters，2003，225（2）：235239.

[10]WASCHKAU B， WALDECK J， WIELAND S， et al. Generation of readily transformable Bacillus licheniformis mutants [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008，78（1）：181188.

[11]温赛，杨建国. 地衣芽胞杆菌原生质体电转化方法的研究[J]. 中国生物工程杂志， 2015，35（7）：7682.

[12]ARNAUD M， CHASTANET A. DEBARBOUILLE M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable， lowGCcontent， grampositive bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70（11）：68876891.

[13]LE BRETON Y， MOHAPATRA N P， HALDENWANG W G. In vivo random mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB1， a marinerbased transposon [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006，72（1）：327333.

[14]MAAS C， WERR W. Mechanism and optimized conditions for PEG mediated DNA transfection into plant protoplasts[J]. Plant Cell Reports， 1989，8（3）：148151.

[15]ZHANG X Z， ZHANG Y. Simple， fast and highefficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis [J]. Microbial Biotechnology， 2011，4（1）：98105.

[16]陳乃用，印小明. 芽胞杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究[J]. 微生物学报， 1986，26（2）：134142.

[17]JUNICHI S， TAKASHI A. Studies on regeneration media for Bacillus subtilis protoplasts[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1981， 45（12）：28872894.

（责任编辑：杨明丽）