TLC—生物自显影检测26种植物中的抗细菌和抗氧化活性物质

单体江 张伟豪 王松

摘要 我国华南地区植物资源丰富，为快速筛选和检测具有抗菌和抗氧化活性的植物资源，本研究采用甲醇冷浸提取法制备植物提取物，并采用TLC-生物自显影法快速检测其抗细菌和抗氧化活性。活性测定的结果表明，豺皮樟和桂木的抗细菌活性最强，对所有供试细菌均表现出抑制活性，且抑菌斑的最大直径均大于10 mm。红果仔、锡叶藤和山油柑也对所有供试细菌表现出抑制活性，但其活性弱于豺皮樟和桂木。粪箕笃、海金沙和小蜡未表现出任何抗细菌活性，其他供试植物对部分供试细菌表现出抑制活性。白花酸藤子、海南杜英、黄牛木、山油柑和基及树表现出较好的抗氧化活性，抗氧化斑的Rf值范围为0.0～1.0，说明具有较多的活性化合物。TLC-生物自显影法能够快速、有效地筛选和检测具有抗细菌和抗氧化活性的植物提取物，本研究結果为植物资源的开发和利用提供重要的理论依据。

关键词 TLC-生物自显影法； 抗细菌活性； 抗氧化活性

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017308

Abstract Plant resources are wealthy in South China. To rapidly screen and detect the antibacterial and antioxidant activities in plants， methanol cold leaching extraction method was used for the preparation of plant extracts， and the antibacterial and antioxidant activities were detected by TLC-bioautoradiography assay. Litsea rotundifolia andArtocarpus nitidus displayed the strongest antibacterial activities against all the tested bacteria and the maximum diameter of inhibition zone was more than 10 mm.Eugenia uniflora，Tetracera asiatica andAcronychia pedunculata also showed inhibitory activities against all the tested bacteria， but their inhibitory activities were weaker than those ofLitsea rotundifolia andArtocarpus nitidus.Stephania longa，Lygodium japonicum andLigustrum sinensedid not show any antibacterial activity to the tested bacteria. The others exhibited inhibitory activities against parts of the tested bacteria.Embelia ribes，Elaeocarpus hainanensis，Cratoxylum cochinchinense，A. pedunculata andCarmona microphyllashowed better antioxidant activities than the others， and the range ofRf value was 0.0-1.0， which indicated that there were more active compounds in these plants. The results showed that TLC-bioautoradiography assay could screen and detect the antibacterial and antioxidant activities of plant extracts quickly and effectively. This study provides important theoretical basis for the development and utilization of plant resources.

Key words TLC-bio-autoradiography assay； antimicrobial activity； antioxidant activity

自然界中植物资源丰富，从植物中筛选提取生物活性物质一直是国内外研究的重点[1]。植物次生代谢产物是由植物次生代谢产生的许多结构不同的小分子有机化合物，其种类繁多，结构迥异，具有抗菌、抗氧化和抗病毒等多种生物活性，目前已阐明的植物活性次生代谢产物包括萜类、黄酮类、生物碱类、植物肽类、挥发油类、木脂素、鞣质、香豆素、皂苷等[2-7]。植物中的化学成分有数十种甚至数百种，但其中具有抗菌或抗氧化活性的化学成分可能只有一种或几种，生物活性组分的快速检测和筛选是天然活性物质研究中的关键一步，因此建立快速、准确的活性物质筛选方法对活性物质的分离以及新化合物的发现具有重要作用[8]。

薄层层析（TLC）-生物自显影法具有简单快速、样品成分在薄层板上得以保留并能直观显示成分的生物活性的特点[9]。相较于琼脂平板扩散法，供试样品用量更少，而与比浊法、梯度稀释法等比较，操作更为简单，条件要求不高，且快速，易观察，对提取物中化合物的数目和极性也有初步的了解，目前已广泛用于植物和微生物中活性物质的筛选和检测[10-12]。本研究选取华南地区常见的26种植物，采用冷浸提取法提取其次生代谢产物，并通过TLC-生物自显影法快速检测其抗菌和抗氧化活性，以期筛选出具有生物活性的植物提取物，为天然活性产物以及植物资源的开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

供试植物详见表1，共计26种，分属于24科。所有供试植物均于2014年4月25至27日采自华南农业大学校园和广州市火炉山森林公园。 采集标本由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师鉴定。

1.2 供试细菌

供试细菌有6种，分别为桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum （G-）、黄瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans （G-）、根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens （G-）、大肠杆菌Escherichia coli （G-）、番茄疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria （G-）和枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis （G+）。以上菌株均由华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室提供。

1.3 仪器和试剂

超净工作台，苏州净化设备有限公司；三用紫外仪，上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；电子秤，美国双杰电子科技有限公司；三洋高压灭菌锅，松下电器产业株式会社；移液器，Eppendorf生命科技公司；海尔医用冷藏箱，海尔生物医疗有限公司。

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和无水乙醇均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；MTT，美国Sigma-Aldrich集团公司；DPPH，美国Sigma-Aldrich集团公司；硫酸链霉素，美国Sigma-Aldrich集团公司；LB培养基，广东环凯微生物科技有限公司；薄层层析硅胶，青岛海洋化工厂分厂。

1.4 植物次生代谢产物的制备

采用甲醇冷浸提取法制备植物次生代谢产物。将采集到的植物材料剪碎后分别装入三角瓶，加入甲醇冷浸提取3次，每次7 d。浓缩提取液，水混悬后用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取液即得到各植物的乙酸乙酯层提取物，将其转入西林瓶中，4℃冷藏备用。

1.5 抗细菌活性的测定

采用TLC-MTT-生物自显影法测定各植物粗提物对供试细菌的抑制活性[11-12]。先将植物提取物用乙酸乙酯溶解，而后用直径为0.5 mm的毛细管点样，点样量为5 μL。用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行薄层层析。阳性对照为0.2 mg/mL的硫酸链霉素，点样量为5 μL。向灭菌的LB半固体培养基（琼脂浓度为0.5%）中加入一定量供试菌液（45 mL LB培养基+5 mL供试菌液），将其浓度调至约108 cfu/mL，振荡、均匀。将制备好的菌悬液均匀喷洒到硅胶板上；待培养基在硅胶板上冷却后，将硅胶板置于培养皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的扩散；而后将培养皿置于28℃下保湿培养，12 h后取出硅胶板，在其上均匀喷洒噻唑蓝（MTT），约10 min后即可观察试验结果。硅胶板上有抗菌活性成分处，供试细菌由于受到抑菌成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试菌正常生长，通过MTT显色后出现背景色。通过抑菌斑的迁移率（即Rf值）来初步评价样品中抗菌化合物的数量和极性，根据抑菌斑直徑初步评价化合物的活性和含量。Rf值计算公式如下：

Rf值=抑菌斑与点样处之间的距离展开剂前沿与点样处之间的距离

在实际试验中，由于抑菌斑并不规则，很难确定抑菌斑的中心，因此在本论文中采用抑菌斑前后两端的Rf值来表示抑菌斑的范围，以抑菌斑左右两侧延伸的最大直径来表示抑菌斑的直径。采用正相硅胶在展开剂相同的条件下，Rf值与化合物的极性成反比，即Rf值越大，化合物的极性越小，Rf值越小，化合物的极性越大。

1.6 抗氧化活性的测定

采用TLC-DPPH-生物自显影法测定各植物提取物的抗氧化活性[13]。薄层层析的方法同1.5，待溶剂挥发后，喷施0.1% 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 无水乙醇溶液显色，具有抗氧化活性的区域呈荧光黄色，不具有抗氧化活性的区域为原色。通过抗氧化活性化合物的迁移率（即Rf值）和抗氧化斑的最大直径初步评价抗氧化化合物的极性和含量。Rf的计算同1.5。

2 结果与分析

2.1 不同植物提取物对供试细菌的抑制活性

采用TLC-MTT-生物自显影法测定了不同植物提取物对供试细菌的抑制活性，其结果如表2和图1b所示。从表中可以明显看出，除粪箕笃、海金沙和小蜡3种植物外，其余23种植物提取物均表现出一定的抗菌活性，但对不同供试细菌的抑菌活性不同。桂木、红果仔、锡叶藤、山油柑和豺皮樟对6种供试细菌均表现出抑制活性，其中抑菌活性最好的为豺皮樟，抑菌斑的最大直径均大于10 mm，Rf值的范围集中在0.00～0.60之间，说明具有抑菌活性的化合物极性中等偏大；其次是桂木， Rf值为0.00～0.13的范围内时抑菌圈的最大直径大于10 mm，说明与豺皮樟相比，桂木中具有抑菌活性的化合物极性偏大，Rf值为0.17～0.38时桂木粗提物表现出微弱的抑制活性，抑菌斑的最大直径在0～5 mm之间。白花酸藤子、海南杜英、破布叶、毒根斑鸠菊、喜树、白兰、美丽异木棉、异叶南洋杉、黄梁木、黄牛木和基及树粗提物对5种供试细菌表现出抑制活性，其中毒根斑鸠菊粗提物除对桉树青枯病菌无抑制活性外，对其他供试细菌的最大抑菌斑直径均大于10 mm；其次是喜树粗提物，虽然抑菌斑直径在5～10 mm，但是活性化合物的Rf值范围为0.00～0.68，说明具有活性的化合物更多。白兰中活性化合物的极性中等偏小，Rf值为0.18～0.98，但大多集中在0.35～0.80，抑菌斑的最大直径差别较大，其中对大肠杆菌和黄瓜角斑病菌的最大抑菌斑直径大于10 mm，与毒根斑鸠菊和喜树一样，白兰提取物对桉树青枯病菌也未表现出抑制活性。猫尾木、铁刀木和海芋粗提物对4种供试细菌表现出抑制活性；鲫鱼胆和海桐粗提物仅对3种供试细菌表现出抑制活性；黄花风铃木粗提物仅对2种供试细菌表现出抑制活性；虽然水茄粗提物仅对大肠杆菌表现出抑制活性，但抑制活性较强，在Rf值0.00～0.25，抑菌斑直径大于10 mm。综上所述，豺皮樟和桂木提取物的抑菌活性最强，且具有广谱性，可作为候选的植物资源进一步分析和鉴定其抗菌活性化合物。多数植物提取物对不同供试细菌均具有一定的抑制活性，可根据其供试细菌选择相应的植物提取物。不同植物提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制活性无明显差异。

2.2 不同植物提取物的抗氧化活性

采用TLC-DPPH-自显影法测定了26种植物提取物的抗氧化活性，其结果如表3和图1c所示。所有供试植物均表现出一定的抗氧化活性，但抗氧化斑的最大直徑和Rf值差别较大。从表3可以看出，鲫鱼胆提取物在Rf值0.00～0.18的范围内，抗氧化斑的最大直径大于10 mm，在所有供试植物提取物中表现出最强的抗氧化活性，具有抗氧化活性的化合物极性偏大；如果Rf值在0.92～1.00的范围内，抗氧化斑的最大直径在5～10 mm，则表明具有抗氧化活性的化合物极性偏小，本试验中白花酸藤子、黄花风铃木、猫尾木、铁刀木、海南杜英、喜树、美丽异木棉、小蜡、水茄、黄牛木、山油柑、豺皮樟和基及树提取物的最大抗氧化斑直径在5～10 mm之间，其他供试植物的抗氧化斑直径均小于5 mm。另外，从Rf值的范围来看，白花酸藤子、海南杜英、黄牛木、山油柑和基及树中具有抗氧化活性化合物的Rf值范围较大，几乎在0.00～1.00的范围内均具有抗氧化活性。综上所述，虽然鲫鱼胆的抗氧化斑直径最大，但化合物的Rf值范围窄，说明具有抗氧化活性的化合物少，同时具有抗氧化活性的化合物极性太大或太小，不利于化合物的分离和鉴定，因此更适合从白花酸藤子、海南杜英、黄牛木、山油柑和基及树中分离纯化具有抗氧化活性的化合物。

3 讨论

本试验的研究结果表明，多数植物粗提物表现出较好的抑菌活性和抗氧化活性，其中不乏优良的活性成分待选者。植物源农药具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性、种类多、开发途径多等特点[14]。豺皮樟、桂木、红果仔、锡叶藤和山油柑的抗菌活性以及白花酸藤子、海南杜英、黄牛木、山油柑和基及树的抗氧化活性均具有较好的开发和应用前景。陈佳龄等对红果仔叶挥发物进行研究，发现其富含保健性挥发成分[15]；红果仔果实和叶片中的多酚黄酮具有较好的抗氧化活性[16-17]，同时红果仔提取物对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有较强的抑制活性[18]，本试验中红果仔粗提物对6种供试细菌表现出抑制活性，说明红果仔粗提物中含有较多的抗细菌成分。山油柑茎皮和木质部挥发物具有细胞毒活性[19]，同时对金黄色葡萄球菌、肠沙门氏菌和表皮葡萄球菌也表现出抑制活性[19-20]；山油柑的甲醇提取物具有较好的抗氧化活性[21]，与本试验的研究结果一致。综上所述，本研究中筛选出的部分植物确实具有抗菌、抗氧化以及细胞毒等多种生物活性，但本研究侧重于对农业和林业病原细菌的研究。此外，严小红对豺皮樟提取物和挥发油进行成分分析，锡叶藤和豺皮樟化学成分已有报道，但均未见其生物活性相关报道[22-24]，而在本次试验中两种植物都表现出了较强的抗菌与抗氧化活性，值得深入研究。 近几年通过薄层层析（TLC）联合使用MTT、DPPH、TTC、Cu2+-新亚铜灵试剂等药品，可直接显示相应的生物活性[25-27]，本研究的结果表明，TLC-生物自显影法是一种快速有效的筛选活性提取物的方法，可根据斑点的Rf值来初步评价样品中化合物的数量和极性，根据斑点的大小来初步评价化合物的活性，简单直观地显示样品中生物活性成分。本文只对乙酸乙酯层粗提物进行了活性筛选和检测，对于乙酸乙酯提取后的剩余部分是否具有活性还有待于进一步研究。此外，对筛选出的候选植物可进一步分离和鉴定活性成分，以阐明具有生物活性的化合物的结构，从而为天然活性药物的开发提供理论依据，为植物资源的开发和利用奠定基础。

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（责任编辑：田 喆）