碱液处理-活性炭柱固相萃取结合GC-MS/MS法检测鱼干、虾皮和虾仁中8种N-亚硝胺

翟孟婷，王宗义，徐 芮，杨 曼，马蒙蒙，王国庆

(北京农学院，食品科学与工程学院，食品质量安全北京实验室，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206)

N-亚硝胺(N-nitrosamines)主要由前体物质亚硝酸盐和胺类物质在适当条件下反应产生[1-2]。研究显示，N-亚硝胺可能是某些癌症发病率升高的诱因之一[3-4]。由于鱼干、虾皮和虾仁富含蛋白质，其降解产生的胺类物质为形成N-亚硝胺提供了条件。目前,我国规定肉制品和水产品中N-二甲基亚硝胺(NDMA)的安全限量分别为3 μg/kg和4 μg/kg[5]，尚未规定其他N-亚硝胺类物质的限量值。

食品中N-亚硝胺的检测方法主要有气相色谱-热能分析(GC-TEA)法[6-7]，液相色谱-荧光检测(HPLC-FD)法[8]，气相色谱-质谱(GC/MS)法[9-11]，气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法[12-13]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[14-15]等。其中GC-MS/MS和LC-MS/MS具有优异的信噪比和选择性，近年来获得了较多应用。然而，由于样品基质复杂、目标物通常为μg/kg级，样品前处理是N-亚硝胺检测的关键和难点，通常需经提取、净化和富集等复杂过程。GB/T 5009.26—2003[16]和GB/T 5009.26—2016[17]采用水蒸气蒸馏提取-液液萃取净化-K-D浓缩器浓缩或旋转蒸发-氮吹浓缩的方法，虽然具有适应性广和基质效应小等优点，但需大量的有机试剂，且耗时、费力，不能进行高通量处理。也有文献报道采用顶空固相微萃取[7,11]、固相萃取[18-19]、分散液液微萃取[20-21]、分散固相萃取[13,22]和QuEChERS[23-24]等方法，用适当溶剂提取样品，但NDMA的检出限通常不能满足要求。

本研究拟采用碱溶液处理样品，使基质中N-亚硝胺转移至水溶液中[25-26]，并使用活性炭小柱对水中N-亚硝胺净化富集[27-28]，以稳定同位素标样为内标，GC-MS/MS法检测分析鱼干、虾皮和虾仁中N-亚硝胺，希望为食品中N-亚硝胺的检测提供新途径。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 7890B-7000C气相色谱-串联质谱联用仪：美国Agilent公司产品；Centrifuge 5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；12孔固相萃取装置：上海安谱科学仪器公司产品；BF-2000氮吹仪：北京八方科技世纪有限公司产品；MJ-WBL2501B搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司产品。

1.2 材料与试剂

Sep-Pak®Plus AC-2小柱：美国Waters公司产品；50 mL塑料离心管、10 mL塑料管：美国BD Biosciences公司产品；鱼干、虾皮、虾仁：均购自北京回龙观地区超市。

N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二正丙胺(NDPA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基二正丁胺(NDBA)混合标准溶液(2 000 mg/L)：均为美国o2si公司产品；NDMA-d6甲醇溶液、NDPA-d14甲醇溶液、NPYR-d8甲醇溶液：均为1 000 mg/L，美国Accustandard Inc公司产品；二氯甲烷、乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国J.T.Baker公司产品；Ba(OH)2·8H2O：分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.3 标准溶液的配制

分别用二氯甲烷稀释定值混合标准溶液和3种定值内标溶液，得到200 mg/L的混合标准储备液和100 mg/L的混合内标储备液，于棕色贮液瓶中-18 ℃储存。

用甲醇分别稀释混合标准储备液和混合内标储备液，得到浓度为1、0.1 mg/L的混合标准中间工作液，和浓度为1 mg/L的NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8内标混合液。

向混合标准中间工作液中加入适量的内标混合液，用二氯甲烷稀释至浓度分别为1、5、10、25、50、100、200 μg/L，内标浓度均为50 μg/L的标准工作液。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：DB-WAXUI柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；程序升温：35 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至90 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持6 min；载气：He(纯度>99.999%)，流速0.9 mL/min；进样量1 μL；进样口温度190 ℃；不分流进样。

1.4.2质谱条件 电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟5 min；多反应监测(MRM)模式检测，参数列于表1。

1.5 样品前处理

称取10 g破碎混匀的样品于50 mL离心管中，加入50 μL 1 mg/L的内标混合液，静置1～5 min，使内标溶液充分吸收，加入1 g Ba(OH)2·8H2O，并加水至刻度线，拧紧盖子，于80 ℃烘箱中处理10 min，取出后涡旋混匀，再置于烘箱处理1 h，取出后以10 000 r/min离心10 min，备用。将Sep-pak®plus AC-2小柱置于固相萃取装置上，上接50 mL盛样管(底部放少许玻璃棉)，依次用6 mL二氯甲烷、甲醇和水活化小柱，加载上清液，开启抽真空泵，控制样品溶液约1～3滴每秒，待全部样液流过小柱后，继续抽干0.5 h。用5 mL二氯甲烷洗脱小柱，并收集流出液于10 mL离心管中，室温氮吹至1 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

表1 8种N-亚硝胺和3种稳定同位素标记N-亚硝胺的MRM参数Table 1 MRM parameters of 8 N-nitrosamines and 3 stable isotope-labeled N-nitrosamines

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

据文献报道[18,23]，食品中挥发性N-亚硝胺可在中等、强极性毛细管色谱柱上获得良好分离。本实验对比了DB-1701柱和DB-WAXUI柱 (均为30 m×250 μm×0.25 μm)的分离效果。结果表明，在DB-1701柱上NDMA流出较快，NDMA的2个二级离子m/z44、42容易受共流出物的干扰，导致这2个离子信号异常，给定性和定量分析带来困难；而DB-WAXUI柱可有效分离NDMA与共流出物，N-亚硝胺标样(含内标)和加标浓度3 ng/g鱼干样品的总离子流MRM色谱图示于图1a～b，二者的NDMA母离子m/z74 的2个子离子m/z42、44对应的MRM色谱图分别示于图1c～d和图1e～f，均可与相同质荷比的干扰离子有效分离。因此，本实验选择DB-WAXUI柱进行分离。此外，兼顾灵敏度和基质效应，对母离子和子离子进行了筛选，以干扰较小的离子对作为定量离子对，结果列于表1。

2.2 样品前处理

由于碱性条件不利于形成N-亚硝胺[3]，使用NaOH溶液处理样品可使脂肪皂化，以便N-亚硝胺充分转移至水溶液,但NaOH易使提取液浑浊、粘稠，且不易通过离心达到澄清[20-21]。本研究使用Ba(OH)2作为处理剂，Ba2+可促进蛋白沉淀，且Ba(OH)2溶解度小，当提取液冷却后，Ba(OH)2沉淀会从溶液中析出，从而促进离心分离，使离心液澄清，所得样品溶液粘度小，有利于后续的活性炭柱净化富集。此外，Ba(OH)2腐蚀性小，使用时以固体方式加入，操作方便。

本实验优化了Ba(OH)2的用量、处理时间和温度。结果表明，Ba(OH)2用量过大容易堵塞小柱，加入1 g时效果较好；处理时间过长易使样液发生褐变，处理时间为1 h时，离心上清液中的油脂层消失，说明油脂已经皂化完全；处理温度超过100 ℃时，离心管容易变形、漏液，故选择处理温度为80 ℃。

水溶液中N-亚硝胺的富集净化主要采用活性炭小柱，本实验选择Sep-Pak®Plus AC-2小柱，参考文献[28]方法富集净化样品。经碱液处理、活性炭柱固相萃取，可对8种N-亚硝胺有效富集和净化，该方法省时、省力、环境友好，可显著提高工作效率。

2.3 方法验证

2.3.1检出限和定量限 虽然鱼干的总离子流色谱图基质峰较虾皮、虾仁复杂，但在本方法条件下，3类样品的LOD和LOQ区别不明显，其中NDMA的LOD和LOQ分别为0.09 μg/kg和0.33 μg/kg，能够满足水产品中NDMA的监测需求。8种N-亚硝胺在1～200 μg/L浓度范围内的线性关系良好，线性相关系数R2≥0.998，其结果列于表2。

注：1.NDMA-d6；2.NDMA；3.NMEA；4.NDEA；5.NDPA-d14；6.NDPA；7.NDBA；8.NPIP；9.NPYR-d8；10.NPYR；11.NMOR图1 标样(a)、加标浓度3 ng/g鱼干样品(b)的总离子流MRM色谱图，标样(c，d)和鱼干样品(e，f)NDMA子离子对应的MRM色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of standard samples (a) and dried fish samples (b),MRM chromatograms of NDMA in standard samples (c, d) and dried fish samples (e, f)

分析物Analytes线性回归方程Linearregressionequations相关系数Correlationcoefficients(R2)线性范围Linearranges/(μg/L)检出限LODs/(μg/kg)定量限LOQs/(μg/kg)NDMAy=1 2098x+0 01180 99931～2000 090 33NMEAy=0 5708x+0 00210 99971～2000 050 27NDEAy=0 2969x-0 00150 99981～2000 250 85NDPAy=1 5511x-0 00990 99971～2000 040 12NDBAy=2 2561x-0 01890 99981～2000 190 62NPIPy=1 2542x+0 00970 99961～2000 080 28NPYRy=0 3568x+0 01380 99821～2000 200 70NMORy=3 5931x-0 03150 99991～2000 030 10

注：y表示峰面积比；x表示浓度比

2.3.2准确度和精密度 在考虑样品本底值的基础上，对3类样品在3种浓度水平进行6次平行加标回收实验，结果列于表3。分别以NDMA-d6为NDMA、NMEA、NDEA的内标，NDPA-d14 为NDPA、NPIP和NDBA的内标，NPYR-d8为NPYR、NMOR的内标。除NDBA高水平添加的回收率略低(可能与NDBA的稳定性有关)，为52.1%～69.0%外，其他化合物的回收率均在71.3%～119.0%之间，RSD为0.65%～15.4%，准确性和精密度良好。

表3 样品中8种挥发性N-亚硝胺的回收率及精密度Table 3 Recoveries and precisions of 8 volatile N-nitrosamines

续表3

注：─表示本底值远大于添加值，未做计算

2.4 实际样品测定

应用本方法检测了购自本地超市的鱼干、虾皮和虾仁共23个产品，其中包括8个即食鱼干、5个生鱼干、4个虾皮、6个虾仁样品。每个样品平行测定2次，结果列于表4。从3类样品中均检出NDMA，其他N-亚硝胺被不同程度检出； NDMA在鱼干中含量最高，虾皮次之，虾仁最低，但总体均值均高于安全限量；即食鱼干中NDMA含量显著高于生鱼干，说明加工过程或辅料[29]促进了NDMA的生成。除即食食品外，这些水产品在烹饪过程中会挥发损失一部分N-亚硝胺，人体摄入量相对较小。因此，NDMA的食品安全风险还有待进一步探讨。

表4 实际样品中8种N-亚硝胺的含量Table 4 Contents of eight N-nitrosamines in actual samples

注：ND表示未检出；r表示含量范围；a表示均值；─表示未计算

3 结论

本研究建立了Ba(OH)2溶液处理-活性炭柱固相萃取，结合GC-MS/MS检测鱼干、虾仁和虾皮中8种N-亚硝胺的方法。该方法的样品处理简单、环境友好、定性定量分析可靠，可满足食品中N-亚硝胺检测的需求。

参考文献：

[1] 蔡鲁峰,李娜,杜莎,等.N-亚硝基化合物的危害及其在体内外合成和抑制的研究进展[J]. 食品科学,2016,37(5):271-277.

CAI Lufeng, LI Na, DU Sha, et al. Progress in hazards, synthesis and inhibition ofN-nitroso compounds in vitro and in vivo[J]. Food Science, 2016, 37(5): 271-277(in Chinese).

[2] MIRVISH S S. Formation ofN-nitroso compounds: chemistry, kinetics, and in vivo occurrence[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1975, 31(3): 325-351.

[3] TRICKER A R, PREUSSMANN R. CarcinogenicN-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential[J]. Mutation Research, 1991, 259(3/4): 277-289.

[4] BOUVARD V, LOOMIS D, GUYTON K Z, et al. Carcinogenicity of consumption of red and processed meat[J]. Lancet Oncology, 2015, 16(16): 1 599.

[5] GB 2762—2017 食品安全国家标准食品中污染物限量[S]. 北京：中国标准出版社，2017.

[6] 张红，杨保刚. 气相色谱-热能分析仪测定水产品中N-亚硝胺[J]. 食品研究与开发,2014,35(24):125-127.

ZHANG Hong, YANG Baogang. Determination of volatileN-nitrosamines in aquatic products by thermal energy analyzer using gas chromatography[J]. Food Research and Development, 2014, 35(24): 125-127(in Chinese).

[7] ANDRADE R, REYES F G R, RATH S. A method for the determination of volatileN-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA[J]. Food Chemistry, 2005, 91(1): 173-179.

[8] KOMAROVA N V, VEIKANOY A A. Determination of volatileN-nitrosamines in food by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2001, 56(4): 359-363.

[9] 赵华，王秀元，王萍亚，等. 气相色谱-质谱联用法测定腌制水产品中的挥发性N-亚硝胺类化合物[J]. 色谱,2013,31(3):223-227.

ZHAO Hua, WANG Xiuyuan, WANG Pingya, et al. Determination of volatileN-nitrosamine compounds in saltedaquatic products by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(3): 223-227(in Chinese).

[10] 吴燕燕，刘法佳，李来好，等. GC-MS检测咸鱼中N-亚硝胺的条件优化[J]. 南方水产科学,2012,8(4):16-22.

WU Yanyan, LIU Fajia, LI Laihao, et al. Determination and optimization ofN-nitrosamines in salted fish by gas chromatography-mass spectrometry[J]. South China Fisheries Science, 2012, 8(4): 16-22(in Chinese).

[11] YUAN Y, WEI M, MIAO Y T, et al. Determination of eight volatile nitrosamines in meat products by ultrasonic solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry method[J]. International Journal of Food Properties, 2015, 18(6): 1 181-1 190.

[13] 赵博,邓美林,杨小珊,等. 分散固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中9种N-亚硝胺类化合物[J]. 色谱,2016,34(10):998-1 004.

ZHAO Bo, DENG Meilin, YANG Xiaoshan, et al. Determination of nineN-nitrosamines in animal derivedfoods by dispersive solid-phase extraction-gaschromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(10): 998-1 004(in Chinese).

[14] HERRMANN S S, DUEDAHL-OlESEN L, GRANBY K. Simultaneous determination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation[J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1 330(4): 20-29.

[15] 罗茜，王东红，王炳一，等. 超高效液相色谱串联质谱快速测定饮用水中9种N-亚硝胺的新方法[J]. 中国科学:化学,2011,(1):82-90.

LUO Qian, WANG Donghong, WANG Bingyi, et al. A new method for rapid determination of 9N-nitrosamines in drinking water by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chinese Science: Chemistry, 2011, (1): 82-90(in Chinese).

[16] GB/T 5009.26—2003 食品中N-亚硝胺类的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2003.

[17] GB/T 5009.26—2016 食品中N-亚硝胺类的测定[S]. 北京：中国标准出版社，2016.

[18] 夏晓楠，王宗义，赵依芃，等. 水蒸气蒸馏-活性炭柱固相萃取/GC-MS/MS 法测定火腿中8 种N-亚硝胺[J]. 分析试验室,2015,34(12):1 475-1 479.

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XIA Xiaonan, WANG Zongyi, ZHAO Yipeng, et al. Steam distillation combined with active carbon solid phase extraction for the determination of eight volatileN-nitrosamines in ham products by GC-MS/MS[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2015, 34(12): 1 475-1 479(in Chinese).

[19] 何淑娟，赵丽敏，李强，等. 气相色谱-质谱法测定肉制品中的9种挥发性N-亚硝胺类物质[J]. 肉类研究,2015,29(1):27-30.

HE Shujuan, ZHAO Limin, LI Qiang, et al. Determination of nineN-nitrosocompounds in meat products by gas chromatograph-mass spectrometry[J]. Meat Research, 2015, 29(1): 27-30(in Chinese).

[20] AMELIN V G, LAVRUKHIN D K. Combination of microwave heating extraction and dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of nitrosoamines in foods using gas-liquid chromatography with a mass-spectrometric detector[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2016, 71(4): 359-364.

[21] RAMEZANI H, HOSSEINI H, KAMANKESH M, et al. Rapid determination of nitrosamines in sausage and salami using microwave-assisted extraction and dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry[J]. European Food Research and Technology, 2015, 240(2): 441-450.

[22] HUANG M C, CHEN H C, FU S C, et al. Determination of volatileN-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography-chemical ionisation mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 227-233.

[23] QIU Y, CHEN J H, YU W, et al. Contamination of Chinese salted fish with volatileN-nitrosamines as determined by QuEChERS and gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2017, (232): 763-769.

[24] LEHOTAY S J, SAPOZHNIKOVA Y, HAN L, et al. Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography-tandem mass spectrometry with backflushing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(47): 10 341-10 351.

[26] ALKASEEM M, ALASSAF Z, KARABEET F. Determination of seven volatileN-nitrosamines in fast food[J]. Pharmacology & Pharmacy, 2014, 5(2): 195-203.

[27] BOYD J M, HRUDEY S E, LI X F, et al. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography mass spectrometry analysis of nitrosamines in treated drinking water and waste water[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2011, 30(9): 1 410-1 421.

[28] YOON S, NAKADA N, TANAKA H. A new method for quantifyingN-nitrosamines in waste water samples by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 97(16): 256-261.

[29] 张甜，杨华. 模拟条件下香辛类蔬菜对N-二甲基亚硝胺形成的影响[J]. 食品科学,2017,38(1):159-164.

ZHANG Tian, YANG Hua. Effects of spicy vegetables on the formation ofN-nitrosodimethylamine under simulated conditions[J]. Food Science, 2017, 38(1): 159-164(in Chinese).