二氧化碳浸渍法和传统法酿造条件下玫瑰香葡萄酒香气成分的对比分析

李凯,田淑芬，黄建全，商佳胤，黄春芳

(天津市设施农业研究所，天津，301700)

玫瑰香葡萄(VitisviniferaL. cv. Muscat Hamburg)，也叫麝香葡萄，原产于英国，欧亚种，是著名的鲜食、制汁和酿酒兼用品种，是我国渤海湾地区主栽品种[1]，由于其香气浓郁，典型性强，是酿造特色葡萄酒的重要原料。

香气质量是葡萄酒感官质量评价中的重要参考因素，香气成分是构成香气质量的重要方面，可以体现葡萄酒典型性和风格。重要葡萄酒中检测到的挥发性化合物多达800余种，其中主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、萜类、萜烯类、硫醇类和甲氧基吡嗪类[2]，这些香气化合物除了来源于葡萄果实[3-4]，还来源于发酵过程[5-8]和陈酿储藏过程[9]，因此酿造工艺对葡萄酒香气成分的组成及含量具有重要影响。目前葡萄酒酿造中使用的方法有连续发酵法、旋转罐发酵法、热浸渍工艺和CO2浸渍发酵等，其中CO2浸渍法是将部分破碎或完全不破碎的整粒葡萄浆果置于充满CO2的密闭容器中，先进行厌氧性细胞内发酵，之后进行酒精发酵，所酿制的葡萄酒色泽鲜艳，香气浓郁，且酸度低、成熟快，富有新鲜悦人的果香味与醇美协调的酒香味，具有独特的风格[10-11]。

国内已有许多研究者采用气相色谱-质谱分析法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析玫瑰香葡萄酒中香气成分的相对含量[12-14]或绝对含量[15-16]，尚未涉及关键呈香成分的研究，也有研究者分析了两性花毛葡萄[17]和酿酒品种美乐[18]采用CO2浸渍法酿造后的香气成分，然而CO2浸渍法对玫瑰香葡萄酒关键香气成分影响的研究较少。本实验以天津产区玫瑰香葡萄酒为研究对象，采用固相微萃取技术提取葡萄酒香气成分，用气相色谱-质谱分析法对葡萄酒香气成分进行检测，利用内标-标准曲线法量化分析并结合主成分分析(principal component analysis,PCA)[19-20]及气味活度值(odor activity value,OAV)[21-22]，对比分析CO2浸渍法和传统法酿造条件下玫瑰香葡萄酒的香气成分，以便为客观评价葡萄酒香气质量及优化工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酒样

试验以玫瑰香葡萄为原料，于2016年9月8日采自天津宁河区，可溶性固形物含量为17 Brix°，成熟度一致，无病害。根据酿造方法将酒样分为两组，其中酒样W1-W9为CO2浸渍法发酵组(处理组)，考虑到CO2浸渍过程中的破碎程度、CO2浸渍时间和酵母等变量因素，参照正交试验设计9个处理，反映不同工艺条件下的CO2浸渍法；W10-W12为传统法发酵组(对照组)，不进行CO2浸渍，直接进行酒精发酵；试验主要研究两组酒样之间的差异。酿造过程参照李华等人的葡萄酒基本酿造工艺[11]，采用40 L不锈钢罐进行小容器发酵。按表1所示，采用CO2浸渍法时，将不同程度破碎的葡萄填入预先充入CO2的发酵罐中，加入SO260 mg/L，按照浸渍时间要求，进行CO2浸渍，浸渍温度为30 ℃。浸渍完成后出罐，除梗破碎，葡萄醪转入发酵罐；对照组为酒样10～12，采用传统法，不经过CO2浸渍，除梗破碎，葡萄醪转入发酵罐，加入SO260 mg/L。发酵罐中的葡萄醪均按照30 mg/L的质量浓度添加果胶酶，12 h后按照200 mg/L的质量浓度添加商业酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，用质量分数5%的蔗糖水在37 ℃下活化 30 min后添加)。待发酵启动后，每隔4～6 h测定1次温度与比重，并压酒帽，控制发酵温度在26 ℃左右。待比重降到 0.992～0.996，并基本维持不变后进行皮渣分离。最后向酒样中加入60 mg/L的SO2，储藏备用。

表1 CO2浸渍法和传统法酿造试验设计表Table 1 The experiment designs of carbonic macerationmethod and traditional method

1.1.2 仪器与试剂

无水乙醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；标样：β-蒎烯、柠檬烯、异松油烯、(+)-4-蒈烯、里那醇、玫瑰醚、α-松油醇、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、异丁酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、辛酸甲酯、丁二酸二乙酯、水杨酸甲酯、乙酸辛酯、辛酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、己酸异戊酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸香茅酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、十四酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、苯甲醇、2-苯乙醇、正癸醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-壬酮、2-癸酮、辛酸、苯乙烯、2-辛醇，均购自Sigma-Aldrich公司；气相质谱联用仪：5977A-7890B GC-MS联用仪(Agilent，美国)；CTC自动进样装置(Agilent，美国)；萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS型极性(Supelco，美国)；色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25mm×0.25 μm，Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒基本理化指标分析

可溶性固形物、总糖、可滴定酸、挥发酸、干浸出物、酒精度和pH的测定均参照王华等人[23]的方法。

1.2.2 气相色谱-质谱仪(GC-MS)分析条件

色谱条件：载气(高纯氦气)：纯度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比为5∶1；升温程序：35 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至200 ℃，以30 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；进样口温度：250 ℃。

质谱检测条件： 离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；电子轰击源70 eV；扫描范围30～300 amu。

1.2.3 定性定量分析

利用顶空固相微萃取-气质联用( HS-SPME-GC-MS)分析方法。

定性分析： 对检测的挥发性成分通过未知物分析软件(美国Agilent 公司)与NIST 11.L谱库(美国Agilent公司) 提供的标准谱图进行匹配，如果匹配因子大于80(最高100)，通过相同GC-MS条件下标准品的保留时间和质谱图进一步比对确认。

定量分析：称取2.4 g NaCl于20 mL顶空瓶中，然后加入葡萄酒样8 mL，并加入内标物2-辛醇8 μL(450 mg/L，无水乙醇稀释)，顶空瓶加盖密封后待测。CTC固相微萃取条件：45 ℃预热5 min，磁力搅拌子转速为250 r/min(搅拌间歇式运行，转5 s，停2 s)，45 ℃萃取50 min，然后GC进样，250 ℃解吸2 min，采集数据。目标化合物峰面积积分采用选择离子模式(SIM)，采用内标-标准曲线法定量，标准曲线由5点绘制，由化学工作站计算定量结果。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒基本指标

如表2所示，所有酒样的总糖含量均小于4 g/L，可滴定酸含量在3.88～5.55 g/L之间，挥发酸含量均低于0.42 g/L，葡萄酒的色度值在0.88～1.89之间，酒体颜色呈浅橙红色。对于其他指标，如干浸出物、酒精度等均符合葡萄酒国家标准GB 15037—2006[24]的要求。

表2 葡萄酒的基本理化指标Table 2 The basic physical-chemical indexes of wines

2.2 葡萄酒中香气定量分析

通过顶空固相微萃取(head space solid phase microextractions，HS-SPME)和GC-MS 联用技术对材料进行香气成分含量分析，葡萄酒香气成分含量见表3。

表3 玫瑰香葡萄酒中香气成分的含量Table 3 The content of aroma components in Muscat Hamburg wines

续表3

通过定性分析，共检测出54种香气成分。按照结构和特性将香气成分分为6类，分别是萜烯类、酯类、醇类、酮类、脂肪酸类和芳烃类。由图1可以看出，不同酒样的总香气含量方面存在差异，所有酒样的香气成分均以醇类和酯类为主，其中醇类含量最高，酯类次之，其余类型含量较低。所有酒样香气成分的总含量在117.10～142.40 mg/L，其中萜烯类包括9种香气成分，总量在649.80～1 617.30 μg/L，该类香气成分含量较低，仅占总含量的0.55%～1.21%，其中β-蒎烯、里哪醇、香茅醇和香叶醇的含量相对较高(>100 μg/L)。值得注意的是，经过CO2浸渍处理的9个酒样(W1～W9)的萜烯类含量全部高于3个对照组酒样。酯类香气成分的种类最丰富，共检测到30种香气成分，但含量仅占总含量的25.38%～32.76%，远低于醇类；乙酸乙酯含量最高，在24 555.90～27 973.40 μg/L。醇类虽然只有9种香气成分，但含量最多，占香气成分总含量的65.27%～72.89%，其中3-甲基-1-丁醇在所有香气成分中含量最高。此外还检测出4种酮类成分、1种脂肪酸和1种芳烃，值得关注的是，在CO2浸渍发酵的9个酒样中全部检测到微量的苯乙烯(6.07～37.73 μg/L)，而传统发酵条件的玫瑰香葡萄酒中均未检测到。

图1 玫瑰香葡萄酒香气成分含量比较
Fig.1 Comparison of aroma component content in Muscat Hamburg wines

2.3 香气含量的主成分分析

主成分分析法利用降维思想，通过研究指标体系的内在结构关系，把多指标转化成少数几个相互独立而且包含原有指标大部分信息的综合指标，得到的综合指标(主成分)之间彼此独立，减少信息的交叉，使得分析评价结果具有客观性和准确性[25]。根据香气定量分析结果，将所有玫瑰香葡萄酒的香气成分含量构成一个12×54的原始数据矩阵，然后运用SPSS v 17.0数据处理系统对54个成分指标进行处理，最终提取出8个主成分，它们的累计方差贡献率为96.98%(表4)。

表4 提取8个主成分的方差解释Table 4 Analysis of variance of 8 principal factors

其中前两个主成分可以解释总方差的68.657%，根据酒样在前两个主成分上的分布(图2-a)，处理组和对照组之间的差异明显，处理组9个酒样中的8个均聚集在第一和第二象限聚集，而对照组则全部聚集在第四象限。对于酒样W9，可能是由于CO2浸渍时原料破碎程度最大(20%)，且浸渍时间最长(15 d)，导致该酒样与处理组其它8个酒样之间的香气成分差异明显，因此在分析处理组的特征香气时，以聚集在第一和第二象限的8个酒样为主。根据香气成分在前两个主成分上的分布(图2-b)，处理组特征香气成分包括丙酸乙酯、乙酸丙酯、水杨酸甲酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇、苯乙烯，这10种香气成分与处理组8个酒样在前两个主成分上的分布特征一致，均与第2主成分呈正相关，在含量上的表现为处理组浓度普遍高于对照组；而对照组特征香气成分为乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮、2-癸酮，这11种香气成分与对照组的3个酒样在前两个主成分上的分布特征一致，均与第1主成分呈正相关，同时与第2主成分呈负相关，在含量上的表现则是对照组浓度显著高于处理组。然而，香气成分实际浓度与香气真正的贡献率并不成正比，而与其气味活度值有着直接关系，气味活度值也体现出香气成分的挥发性大小及难易程度[3]，因此将香气成分含量与阈值结合起来分析，更能客观地认识某种香气成分在葡萄酒香气中的贡献。

a-酒样在前两个主成分上的分布；b-香气成分在前两个主成分上的分布
图2 酒样及香气成分在前两个主成分上的分布
Fig.2 Loadings of aroma components and of wine samples in the first two PCs

2.4 关键呈香成分分析

根据香气值理论，葡萄酒中香气成分含量高且阈值低的成分很可能是葡萄酒的特征香气或主体香气成分[21]。在香气贡献中，由于香气成分之间的相似性，难免有些香气成分之间充斥着重叠和抑制作用，但对于估计单个香气成分实际气味贡献来说，采用气味活度值(OAV)来表征葡萄酒中各香气化合物对主体香气成分的贡献，是目前具有一定参考价值的客观方法[26-27],当OAV大于1时，这种香气成分对香气的贡献和影响较大。根据OAV值，共确定15种关键呈香香气成分(见表5)，包括4种萜类、6种酯类、2种醇类、2种酮类和1种脂肪酸，分别是里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸。

表5 葡萄酒中关键呈香成分Table 5 The key aroma components in wines

15种关键呈香成分中辛酸乙酯的OAV值最高，主要贡献果香和脂肪气味，其他5种酯类的香气描述则是菠萝、苹果和香蕉等果香，因此酯类主要为玫瑰香葡萄酒提供果香。大马酮的OAV值仅次于辛酸乙酯，大马酮属于C13-降异戊二烯衍生物，被认为是潜在影响葡萄和葡萄酒质量的芳香化合物，这类化合物主要来自类胡萝卜素的降解，具有强烈的果香和玫瑰香气，并且具有极低的香气阈值(0.05 μg/L)，它们在提高水果香气特征的同时掩蔽草本香气[33]。里那醇、玫瑰醚、香茅醇和香叶醇都属于萜类化合物，萜类化合物主要来源于果实，在葡萄储藏或发酵过程中很少或不发生改变[34]，是形成品种香气的重要化合物[35]，玫瑰香葡萄独特的品种香气玫瑰味就来自于该类化合物，其中玫瑰醚由于其低嗅觉阈值(0.2 μg/L)，是OAV值最高的萜类化合物，在整体香气中贡献花香、甜香和玫瑰香味。3-甲基-1-丁醇在所有检出香气成分中浓度最高，然而由于其高嗅觉阈值(30 mg/L)，OAV值仅在2.22和2.69之间，乙酸乙酯和2-苯乙醇也同样如此，这也说明某种香气成分具有高浓度并不意味着对葡萄酒整体香气贡献大，而是与其嗅觉阈值密切相关。辛酸属于低级脂肪酸，具有明显奶酪，并夹带粗涩的味感，然而对整体酒质结构具有重要作用，并且可以抑制芳香酯的水解，因此对于香气平衡具有重要作用[36]。SHINOHARA[37]研究表明，高含量(>20 mg/L) 的 C6-C10脂肪酸则具有不良风味的体现，然而低含量时反而能够带来具有愉快的气味，本研究中辛酸浓度范围是0.75～1.31 mg/L，可能会给整体香气带来愉悦气味。15种关键呈香成分的气味描述以令人愉悦的果香和花香为主，同时包括提升香气复杂度的蜂蜜、脂肪和奶酪等香气描述，与感官评价时玫瑰香葡萄酒的香气特征高度一致，这也证明了玫瑰香葡萄酒的香气主要来源于这十几种关键呈香成分。值得我们关注的是，异丁酸乙酯在处理组中的OAV值均小于1，而在对照组中大于1，因此与传统工艺相比，CO2浸渍发酵条件下玫瑰香葡萄酒的关键呈香成分略有减少。

3 结论

本研究通过HS-SPME和GC-MS联用技术分析CO2浸渍发酵对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，共检测出54种香气成分，其中苯乙烯仅在CO2浸渍发酵的酒样中检测到，其余53种香气成分是所有酒样的共有香气成分，包括9种萜烯类、30种酯类、9种醇类、4种酮类和1种脂肪酸类，不同酒样的总香气含量略有差异，但均以醇类和酯类为主。

主成分分析结果显示，CO2浸渍发酵与传统工艺发酵条件下的酒样在前两个主成分上聚集为两类，存在明显差异；CO2浸渍发酵条件下，玫瑰香葡萄酒中丙酸乙酯、乙酸丙酯、水杨酸甲酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-苯乙醇、正癸醇和苯乙烯的浓度较高；传统工艺条件下，玫瑰香葡萄酒中的乙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇、2-壬酮和2-癸酮的浓度较高。

采用气味活度值分析关键呈香成分的结果显示，传统工艺条件下玫瑰香葡萄酒中的关键呈香成分有15种，包括里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸；CO2浸渍发酵条件下玫瑰香葡萄酒中的关键呈香成分减少为14种，不包括异丁酸乙酯。