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甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

2018-05-13费理文王勇

食品与发酵工业 2018年4期
关键词:甜菊糖基转移酶蔗糖

费理文,王勇

1(上海市农业科学院 食用菌研究所,农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,国家食用菌加工技术研发分中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海, 201403) 2(中科院上海生命科学研究院 植物生理生态研究所,上海, 200032)

来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点,受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视。其中含量相对丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)等已广泛应用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域[1-9]。虽然RA和甜菊糖具有高甜度,但是口感上与蔗糖相比仍有除了甜味之外的苦后味等非纯粹甜味[10]。而甜菊糖苷类化合物组分众多,目前已知四十多种组分均具有四环二萜母核及不同程度的糖基化修饰,具有不同程度甜味口感[3, 11-13]。在这一点上莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)具有更好的口感特性,是甜菊糖苷类甜味剂开发的升级方向之一,美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)于2017年认证RD为“一般安全”物质(Generally Recognized as Safe,GRAS)应用于食品行业[14]。

然而甜叶菊中RD这样高品质的组分含量低,仅占干叶质量的约0.5%,用传统分离方法难以得到高纯度产品且产量也无法满足市场需要[3]。为解决这一问题, 欧美等国都在研发甜菊糖苷类化合物的微生物异源合成方法, 期望能够定向、高效地合成高品质的甜菊糖苷组分。目前甜菊糖苷母核以及后续糖基化的生物合成过程及其相关的催化酶已基本清楚,为定向催化合成RD提供了基础[3]。RD可由RA在尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose, UDPG)的存在下经一步糖基转移反应获得,本实验室在前期工作中用水稻糖基转移酶EUGT11构建大肠杆菌异源表达体系,实现体外催化来源相对丰富的前体RA通过一步糖基化反应生产RD[15]。但是该工程菌催化RD产量低下,需要向催化体系外源添加活化糖配体UDPG,而UDPG成本高昂,以外源添加形式进行生产不可行,因此需要进一步探索增加异源催化细胞内源性UDPG供给的改造策略。为了增加大肠杆菌内源性UDPG供应,需要对宿主进行代谢工程改造,主要策略包括两个方面:一方面是对宿主自身的代谢流进行改造,引导代谢物往UDPG富集的方向流动,并且减少UDPG的消耗途径;另一方面是挖掘自然界其他物种的UDPG合成通路,将其引入大肠杆菌系统。本文利用基因重组技术对大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行UDPG合成途径中分支代谢的相关基因敲除改造,并且在染色体中整合可以利用蔗糖并将其磷酸化为UDPG合成前体1-磷酸葡萄糖(glucose-1-phosphate,G1P)的蔗糖磷酸化酶(E.C 2.4.1.7)以及催化UDPG合成的G1P尿苷基转化酶基因,从而实现内源性UDPG的富集。在经UDPG富集化改造的宿主内表达糖基转移酶EUGT11可实现RD的高效全细胞催化(图1)。该项工作探索出了切实可行的大肠杆菌全细胞催化糖基化产物的转化平台催化平台。

图1 改造底盘细胞UDPG合成代谢路径高效催化RA合成RD
Fig.1 Schematic diagram of chassis modification for enhanced biosynthesis of UDPG used in biocatalysis of RD from RA

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

起始菌株E.coliBL21(DE3)为本实验室保藏,其他改造菌株为本实验构建,具体信息见表1。质粒pYF09为本实验室前期构建[15]。

表1 底盘改造菌株与质粒Table 1 Host strains and plasmids used in this study

引物合成及测序:上海生工;各限制性内切酶:New England Biolabs公司;PrimeSTAR Max:大连TaKaRa公司;质粒抽提及DNA片段纯化与胶回收试剂盒:AXYGEN公司;Vazyme ClonExpress II 一步法克隆试剂盒:南京诺维赞;RA标准品(纯度>97%):Thermo Fisher;RD标准品(纯度>95%):四川盈嘉合生物科技;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素及卡纳霉素:上海生工;酵母提取物及胰蛋白胨:OXOID公司;其余各种化学试剂:上海国药集团。

1.2 仪器设备

PCR仪,Thermo Fisher;小型离心机,Eppendorf;高速冷冻离心机,Eppendorf;高效液相色谱仪Ultra 3000,Thermo Fisher(前戴安);摇床,智诚。

1.3 方法

1.3.1 大肠杆菌E.coliBL21(DE3)底盘细胞改造

改造工作分为两个部分,一方面是对E.coliBL21(DE3)1-磷酸葡萄糖(G1P)的非UDPG合成消耗途径进行基因敲除,包括磷酸变位酶基因(phosphoglucomutase,pgm)、1-磷酸葡萄糖腺苷酰基转移酶基因(G1P adenylyltransferase,glgC)以及1-磷酸葡萄糖磷酸酶基因(G1P phosphatases,agp)。这3个基因分别负责将1-磷酸葡萄糖转化成供应糖酵解途径的6-磷酸葡萄糖、形成糖原储存前体ADP-葡萄糖以及降解。另一方面在染色体中引入异源途径,提高G1P以及UDPG的合成。引入染色体的异源基因包括来源于青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)的蔗糖磷酸化酶基因(BasP,NCBI Gene ID: 4556453)以及来源于两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)的G1P尿苷基转化酶基因(UgpA,NCBI Gene ID: 9889115)。各改造菌株信息见表1, 突变菌株SG1~SG4依次敲除基因glgC、pgm、agp以及替换原有UDPG合成酶基因ushA为全合成的包含Basp和ugpA的T5 操纵子。E.coliBL21(DE3)染色体基因敲除参照经改良的λRed-CRISPR/Cas技术方法[16],首先针对各个被敲除基因设计CRISPR/Cas9特异性靶点gRNA,然后设计同源臂,接着构建相应pTargetT-Δ目标基因质粒,电转化含有pCas质粒(表达Cas9)的目标菌株,对目标基因进行无痕敲除(表1和表2)。SG1以E.coliBL21(DE3)为目标菌株,随后的SG菌株依此以前一个SG菌株为基因编辑目标菌株。基因敲除及插入工作均由南京金斯瑞生物科技完成。

表2 基因敲除突变所用gRNA序列Table 2 List of gRNA sequences used for the creation of knockouts

1.3.2 全细胞催化合成RD

将pYF09转化改造菌株,挑取含100 μg/mL氨苄青霉素的LB转化平板上的单克隆接种至含抗生素的液体LB,37 ℃摇床转速250 r/min培养过夜。然后以1%接种量接种至100 mL含抗生素的LB培养基,同样条件培养约1.5 h监测OD600值达到0.3~0.4左右时停止培养,菌液降温至16 ℃左右后加入IPTG诱导,诱导剂IPTG终浓度0.1 mmol/L。随后将培养菌液置于16 ℃,180 r/min转速培养18 h培养结束后离心收集菌体,以100 mmol/L pH 8磷酸钠缓冲液重悬清洗2遍后用于细胞催化反应。基本催化体系为2 mL,以100 mmol/L pH8 磷酸钠缓冲液配制,每mL 含0.2 g 湿菌体、60 mmol/L 柠檬酸三钠、1 mmol/L RA、1 mmol/L UDPG、质量分数5%蔗糖、0.1%体积分数Triton X-100,0.1 mmol/L ZnCl2。催化反应条件为37 ℃,反应时间24 h。随后对SG4菌株的细胞催化进行单因素研究,在体系内完全不添加UDPG的情况下,以基本催化体系和条件为基础分别考察表面活性剂Triton X100体积分数(0、0.1%、0.5%、1%)、磷酸钠缓冲液pH(6.4、7.0、7.2、7.4、8.0)、RA添加浓度(0.25、0.5、1、2、3 mmol/L)、蔗糖质量浓度(0、100、150、200、300、400、500、600 g/L)、菌浓度(25、50、100、200、300 mL培养菌液离心所收集菌体)、柠檬酸钠浓度(0、20、40、60、80、100 mmol/L)、反应温度(20、25、30、37、42、45、50 ℃)及转化时间(0.5、1、2、3、4、5 d)8个因素对全细胞催化RA生产RD能力的影响。每个条件平行3组实验。

1.3.3 检测与统计分析

细胞催化结束后离心取上清,过滤0.2 μm滤膜后由高效液相进行检测。色谱柱Thermo Hypersil Gold AQ 250 mm×4.6 mm×5 μm,检测波长205 nm,柱温控制40 ℃,进样量40 μL。色谱条件为:A相水,B相乙腈,0~5 min 75% A +25% B,5~30 min 从25% B相乙腈浓度升高至65%,30~34 min保持65% B,34~35 min B相比例从65%降至25%,35~40 min 25% B。以标品配置浓度梯度溶液制作标准曲线,RA标准曲线为UV205峰面积=0.260 6×RA浓度-0.931 8;RD标准曲线为UV 205 nm峰面积=0.202 5×RD浓度-0.1357。催化反应结束后的反应体系离心取上清,0.2 μm滤膜过滤后进行液相分析。数据由SPSS软件中GLM one-way ANOVA进行分析。

2 结果与分析

2.1 底盘改造菌株催化RA生产RD

本工作采用蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)催化蔗糖产生果糖和G1P来分流糖酵解与UDPG的生物合成,同时引入UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷转移酶以实现UDPG的富集。表达宿主E.coliBL21(DE3)以方法1.3.1进行不同程度的改造,获得突变宿主菌SG1、SG2、SG3和SG4。将含糖基转移酶EUGT11的重组质粒pYF09分别转化到这些不同程度改造的宿主菌中,同时以原始菌株E.coliBL21(DE3)为阴性对照进行全细胞催化实验,比较不同宿主菌的催化效果。结果显示,各个改造宿主菌发酵生物量无明显差别(图2)。从催化生产RD的结果看,重组大肠杆菌pYF09-SG1及pYF09-SG2同改造前pYF09-BL21(DE3)相比催化活性没有显著差异,pYF09-SG3虽有所提高但差异并不显著,只有pYF09-SG4催化所得RD则比未改造宿主及SG1、SG2有显著提高,SG4宿主催化产生RD达317.3 mg/L(图3)。

图2 表达EUGT11的各重组菌生物量(误差线:±SE)
Fig.2 Biomass of different engineered strains expressing EUGT11

图3 表达EUGT11的不同重组菌株对转化RA生产RD的影响
Fig.3 Effect of different EUGT 11 expressing E. coli strains on biocatalysis of RD from RA
误差线: ± SE; 不同字母比较不同表达EUGT11 突变改造宿主的全细胞催化RA 生产RD 的能力,p<0.05

菌株SG1~SG3均为仅敲除大肠杆菌底盘中原有的G1P消耗途径的突变株,以它们为宿主表达EUGT11催化生产RD的结果显示针对底盘原有G1P的改造并不能有效提高内源UDPG的供应(图3)。而结合引入异源途径增加G1P的合成后,RD产量就获得了显著增加,说明以大肠杆菌为宿主过表达糖基转移酶进行全细胞催化糖基化反应时,仅仅对原有UDPG合成通路进行分支代谢敲除是不够的,还需要引入外源途径方可满足催化反应需要(图3)。针对UDPG代谢通路的改造以提高其内源性供应的尝试已有不少,FAN[17]等人尝试通过增强表达从6-磷酸葡萄糖到UDPG这条代谢路径中的参与酶基因(pgm、ugp、glgX以及spy)来增加内源性UDPG的供给,但除了增加ugp表达之外,其余针对6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate,G6P)及G1P的改造效果并不明显。BRUYN[18-19]等人也发现,仅仅针对底盘自身的G1P消耗通路的相关基因敲除不能有效提高G1P含量,这可能与G6P与G1P均系中心代谢的枢纽,受到严格调控有关。本文中仅敲除E.coliBL21(DE3)G1P消耗途径并不能有效提高RD产量,与前人工作结果一致。现有文献结果表明针对底盘内源性UDPG供给的改造,需要引入外源合成UDPG的模块才能有效提高UDPG供应[18-25],这也与本研究所得结果一致。

2.2 转化条件对转化反应的影响

获得UDPG供给改造工程菌pYF09-SG4后需要进一步研究各催化条件对催化反应的影响。前期以E.coliBL(DE3)为宿主构建工程菌催化生产RD时,已经研究了包括反应缓冲液pH、表面活性剂、细胞用量、柠檬酸钠浓度、UDPG浓度、反应温度、反应时间等催化条件,获得了一些表达EUGT11细胞催化的优化参数[15]。本文针对改造后宿主构建的工程菌可能发生变化的催化条件,均进行了单因素研究。

在不添加外源UDPG进行全细胞催化时,表面活性剂Triton X100的最佳添加量为体积分数0.1%,继续增加用量不仅无法提高RD产量,还会使整个体系在后续分离纯化过程中产生乳化现象,增加分离难度,且高浓度Triton X100还可能存在细胞毒性,降低RD产量(图4-A)。催化反应在磷酸钠缓冲液pH 8.0时效果最佳,这与前期的研究结果一致,提示在催化反应体系pH 8.0糖基转移酶EUGT11效率高(图4-B)[15]。柠檬酸钠浓度在80及100 mmol/L时相较其他低浓度的RD产量更高,可能是在高浓度柠檬酸钠条件下,细胞EMP途径可获得更有效的抑制,即细胞可更好地维持在静息状态进行生物催化反应 (图4-C)。细胞用量在50 mL发酵液对应菌体时RD产量最高(图4-D),过低的细胞用量达不到催化效果,而多余的细胞可能会影响催化体系的传质从而无法实现高效催化,这与前期以BL21(DE3)进行催化的趋势相同[15]。RD产量随底物RA添加量的增加而有所增加,但变化并不显著,提示还有其他更关键的因素在影响生物催化反应(图4-E)。转化时间1 d时达到最高,随后开始下降,2 d后趋于平衡(图4-F)。催化反应最佳温度为42 ℃,进一步升高温度可能破坏蛋白结构,导致催化活性下降(图4-G)。所有条件中,蔗糖浓度对RD产量的影响是最大的,增加体系内蔗糖浓度可以极大提高RD产量,实现〉95%的底物转化,提示低蔗糖浓度条件下UDPG的合成机制没有充分运转起来,导致UDPG供应不足,从而使之成为了整个催化反应的瓶颈(图4-H)。催化反应的体系需要添加500 g/L高浓度蔗糖才能到达最高产量,可能是源于大肠杆菌B株系列的BL21(DE3)缺乏蔗糖透性酶,胞外蔗糖无法有效地进入细胞内部[26]。而高浓度的蔗糖一方面可以通过浓度梯度进入细胞,另一方面可以通过高渗透压导致细胞通透性提高而进入细胞。在SCHMÖLZER[20]的研究中,以E.coliBL21(DE3)为宿主催化合成UDPG,外源添加蔗糖的浓度也高达50%,与本研究结果相似。

A-表面活性剂Triton X100对RD产量的影响;B-缓冲液pH对RD产量的影响;C-柠檬酸钠对RD产量的影响;D-菌量对RD产量的影响;E-RA浓度对RD产量的影响;F-生物转化时间对生产RD的影响;G-催化温度对RD产量的影响;H-蔗糖浓度对RD产量的影响
图4 细胞催化条件对pYF09-SG4生物催化RA生产RD的影响
Fig.4 Effect of different conditions on biocatalysis of RD by pYF09-SG4
(误差线±SE,不同字母表示显著差异,p<0.05)

3 结论

本研究建立了利用水稻糖基转移酶EUGT11及经过UDPG通路改造的大肠杆菌全细胞催化合成甜菊糖苷RD的方法。为了解决大肠杆菌内源糖供体不足UDPG的问题,对E.coliBL21(DE3)进行UDPG合成途径中代谢分支的相关基因敲除改造,同时在染色体中整合了蔗糖磷酸化酶基因(BasP)及G1P尿苷基转化酶基因(UgpA),使UDPG得以富集。以经改造的SG4宿主菌表达EUGT11催化RA生产RD,经过条件优化后可催化1 mmol/L RA(约1 g/L)生成约1.1 g/L RD,底物转化率达98.5%,为工程化生产稀少组分RD奠定了技术基础。

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