谷氨酰胺转氨酶改善内酯豆腐凝胶强度的作用机理

杨海鹏，华欲飞，陈业明，张彩猛，孔祥珍

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214222)

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，简称TGase或TG酶)是一种催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ- 谷氨酰基)赖氨酸共价键的酶,可以催化蛋白质分子之间发生交联，将蛋白质分子黏合起来，改善蛋白质的凝胶性、乳化性等功能特性[1-2]。目前广泛应用于牛、猪、鸡肉等肉制品及豆制品的黏合，改善其口感、风味、组织结构和营养，提高产品附加值[3-6]。

内酯豆腐是优质的植物蛋白食品，是大豆蛋白在GDL作用下相互结合形成的三维网状结构的凝胶产品。其形成机理是GDL在室温下水解为葡萄糖酸，使豆浆pH值降低至大豆蛋白的等电点从而使豆浆凝固，形成内酯豆腐[7-8]。虽然其口感光滑细腻、营养价值高、充填包装便于携带等优点，但是市售内酯豆腐普遍较软，常用于凉拌，不易烹饪进一步加工食用[9-10]。本实验通过研究不同TG酶作用条件对内酯豆腐凝胶强度的改善作用及TG酶的作用机理，为实际生产中TG酶的应用及内酯豆腐品质的改善提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆，普通大豆为市售东北大豆，成分缺失大豆由东北农业大学提供；葡萄糖酸-δ-内酯，江西新黄海医药食品化工有限公司；谷氨酰胺转氨酶，上海东圣食品有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、考马斯亮蓝R250，Sigma-Aldrich公司；标准分子量蛋白，伯乐生命医药产品(上海)有限公司；甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器和设备

BLST4090B-073豆浆机，汇勋电器制品有限公司；垂直电泳仪、凝胶成像仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；TA-XT2质构仪，美国TA仪器公司。

1.3 工艺流程及操作要点

大豆→浸泡→磨浆→煮浆及冷却→加内酯及TG酶→保温处理→灭酶及冷却→酶促内酯豆腐

浸泡：用去离子水清洗，25 ℃下以体积分数0.5%的NaHCO3溶液浸泡12 h。

磨浆：干豆水比1∶7(g∶mL)磨浆后稀释得到固形物含量为8%、pH6.86、蛋白质含量3.60%的生浆。

煮浆及冷却：水浴加热豆浆中心温度95 ℃下保温5 min，迅速冷却到30 ℃以下。

加内酯及TG酶：市售葡萄糖酸内酯为颗粒状，易溶于水；TG酶为粉末状，加入水中易聚集；故以溶液方式加入，先内酯，再加入TG酶，并充分搅拌。

灭酶及冷却：TG酶在70 ℃仍有一定活性，选择95 ℃水浴保温10 min方式灭酶；4 ℃保存以备凝胶强度测量及其他分析。

此外还有基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子C、抗胞质角蛋白、PTEN基因等作为宫颈癌微转移检测的标志物，但文献报道较少，而这些标志物均需要大样本的研究及探索去证实其有效性。

1.4 实验方法

1.4.1 TG酶作用条件对内酯豆腐凝胶强度的影响

以内酯豆腐凝胶强度为指标进行研究。分别研究GDL添加量(0.10%TG酶量，GDL添加量为0、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%；50 ℃+1 h保温处理)(添加量均以质量分数表示)、TG酶添加量(0.30%GDL量，TG酶量为0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%；50 ℃+2 h保温处理)、保温温度(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保温温度：40、45、50、55、60 ℃，保温2 h)、保温时间(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保温时间：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，保温温度50 ℃)对内酯豆腐凝胶强度的影响。

1.4.2 内酯豆腐凝胶强度的测定

采用质构仪中P25探头选择穿刺模式，所有样品均为50 mL豆浆初样放置100 mL烧杯中测量，平行测定3次[11]。测试条件：压缩距离10 mm，测前速度3 mm/s，测中1 mm/s，测后3 mm/s。

1.4.3 SDS-PAGE凝胶电泳样品的制备和分析

豆腐的凝胶电泳方法参照LAEMMLI[12]和闫尊浩[13]的方法。TG酶作用下的内酯豆腐凝胶强度提高，更不易溶于水，取少许豆腐研碎后，用6%的SDS溶液(体积分数)稀释10倍，并搅拌至完全溶解。蛋白电泳中单一条带的相对含量均以第1泳道对应条带含量为参考量1，进行相对含量分析。

1.4.4 统计分析

内酯豆腐的凝胶强度平行测定3次，结果以平均值表示。采用Origin8软件作图，SPSS 17.0数据统计分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 TG酶作用条件对内酯豆腐凝胶强度的影响

由图1-a及实验现象可知，当GDL添加量小于0.20%时，体系pH较高，豆浆不凝固、不成形；当GDL添加量为0.25%～0.35%，体系pH继续下降，接近大豆蛋白的等电点，酶促内酯豆腐的凝固状况改善，凝胶强度也随之增大；GDL添加量大于0.35%，体系pH值继续下降，酶促内酯豆腐中开始析出黄浆水，且黄浆水的质量增加，凝胶强度下降，结构变得粗糙出现孔洞，直至变成松散的浆体。GDL添加量为0.30%时，酶促内酯豆腐凝胶状况最佳，且凝胶强度最大，故GDL的最佳添加量为0.30%。

图1 GDL量(a)、TG酶量(b)、保温温度(c)、保温时间(d)对酶促内酯豆腐凝胶强度的影响
Fig.1 Effect of GDL concerntration(a)，TGase concerntration(b)，reaction temperature(c)，reaction time(d) on rupture strength of lactone Tofu

图1-b显示,加入TG酶可显著增强豆腐的凝胶强度，当酶添加量为0.05%时，凝胶强度达到最大；继续增加TG酶量，内酯凝胶强度逐渐下降。因此，最佳TG酶添加量为0.05%。SAKAMOTO等[14-15]研究发现,随着TG酶量增大,蛋白质分子表面的作用位点可能很快被交联而降低了其与周围其他蛋白分子进行交联的几率，因而形成的分子间交联要比加酶量小的情况要少，而对凝胶强度起改善作用的，应该是蛋白质分子间交联形成空间网络结构。因此，当TG酶量为0.05%时，交联后的蛋白聚集体相对较小，在体系分布中均匀，进一步增大TG酶量，蛋白聚集体进一步交联，形成更大的交联，导致蛋白质在整个体系中分布不均匀，不平衡的结构就容易被破坏，凝胶强度变小。

图1-c显示随反应温度的增加，酶促内酯豆腐的凝胶强度逐渐增加，当温度达到50～55 ℃之间时，凝胶强度达到最大；随着反应温度的继续增加，凝胶强度会显著下降。不同保温温度，TG酶作用下内酯豆腐的凝胶强度、TG酶的酶活性及TG酶作用下内酯豆腐蛋白组分变化情况具有一定的相关性。相关实验证明，不同温度下，TG酶作用下内酯豆腐凝胶强度的变化与TG酶的酶活变化具有一致性。因此，TG酶作用较合适的温度为50～55 ℃之间。

图1-d显示随保温时间的延长，酶更能与蛋白充分作用，使凝胶强度逐渐增加，但考虑生产、成本因素，作用时间应控制在合量的范围内，故本实验选3 h为最长保温时间。

2.2 TG酶作用条件对蛋白组分的影响

2.2.1 TG酶添加量对内酯豆腐蛋白组分的影响

由图2分析可知，当TG酶添加量由0增加到0.05%时，α’、α亚基亦大幅度下降至条带消失，A3肽链直接消失，β、γ亚基和A肽链均有明显下降；随着TG酶量继续增加，β亚基、γ亚基、A肽链、聚合体和B肽链的相对含量均继续缓慢下降，但B肽链变化程度最小。由此推测，7S中的α’、α亚基及11S中的A3肽链与TG酶的作用关系最密切，其次是7S中β、γ亚基及11S中的A肽链，最后可能有关联的是11S中的B肽链。

图2 不同TG酶添加量下酶促内酯豆腐蛋白还原电泳图及蛋白组分相对含量变化
Fig.2 Effect of TGase concerntration on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

2.2.2 保温温度对内酯豆腐蛋白组分的影响

由图3分析可知，电泳条带中7S主要成分α’、α、β、γ亚基，以及11S中的A肽链的相对含量的变化与前两者呈负相关关系，A3肽链只有在70℃酶活比较低的时候存在；且不同温度下，11S中B肽链的相对含量变化不明显。不同温度直接影响TG酶作用的活性，进而影响7S和11S分子间的交联，同时影响酶促内酯豆腐的凝胶强度。因此，可得到同2.3.2一致的结论：7S中的α’、α亚基及11S中的A3肽链与TG酶的作用关系最密切，其次是7S中β、γ亚基及11S中的A肽链，最后可能有关联的是11S中的B肽链。

图3 不同保温温度下酶促内酯豆腐蛋白还原电泳图及蛋白组分相对含量变化
Fig.3 Effect of reaction temperature on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone tofu

2.2.3 保温时间对内酯豆腐蛋白组分的影响

如图4所示，随着TG酶作用时间的延长，浓缩胶上端含量逐渐增加，与TG酶作用下分子间交联形成更大分子量成分有关； 7S中α’和α亚基大幅度下降，β和γ亚基也明显下降；11S中A3肽链在1 h时直接消失，A肽链也明显下降，但B肽链先维持不变后有少量下降。TG酶作用时间从0.5～1 h时，凝胶强度增度最大，同时电泳中α’、α亚基及A3肽链明显下降或消失不见，由此推测这3种成分与TG酶作用关系最为显著，其次为β、γ亚基和A肽链，最后可能有关系的是B肽链[16]。

图4 不同保温时间酶促内酯豆腐蛋白还原电泳图及蛋白组分相对含量变化
Fig.4 Effect of reaction time on reducing SDS3PAGE and protein composition of lactone tofu

2.3 大豆品种对内酯豆腐凝胶强度及蛋白组分的影响

不同品种大豆之间，蛋白质组成及含量,影响豆腐的品质特性[17-18]。图5显示，对于低温内酯豆腐(未加TG酶)，凝胶强度除7S-大豆稍低，其他3者相差不大，即LOX缺失对内酯豆腐凝胶强度影响不明显，但7S缺失降低了其凝胶强度；对于酶促内酯豆腐，豆王牌>恒丰牌>LOX-大豆>7S-大豆。因此，7S缺失不利于TG酶对内酯豆腐凝胶强度的提高。

图5 不同大豆品种对酶促内酯豆腐凝胶强度的影响
Fig.5 Effect of soybean varieties on rupture strength of lactone Tofu

由图6可以清晰看到,TG酶作用下，7S中α’、α、γ亚基及11S中的A3肽链直接消失，7S中β亚基及11S中A肽链亦明显减少，但11S中B肽链变化较之前不明显，与之前结论一致。还原电泳图证实酶促内酯豆腐溶解样中剩余大量未被交联的含有B亚基的组分；非还原条带可以看出酶促内酯豆腐溶解样中并没有游离的B亚基，其中一小部分B以B2的形式存在，另外推断有一部分含有B的成分是以AB的形式形成交联的聚集体，但是B没有直接参与交联，当对这部分聚集体进行还原后，也可以得到B亚基和交联的A，与相关文献结论一致[19-20]。因此，不同大豆品种对内酯豆腐凝胶强度及蛋白组分的SDS-PAGE分析验证了TG酶作用机理的结论。

A-非还原电泳;B-还原电泳
图6 不同品种大豆酶促内酯豆腐蛋白电泳图及蛋白组分相对含量变化
Fig.6 Effect of soybean varieties on SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

3 结论

TG酶量对内酯豆腐凝胶强度影响较大。最佳工艺为：GDL用量0.3%，TG酶用量0.05%，50 ℃保温3 h。此时，内酯豆腐的凝胶强度为570.5 g。

7S中的α’、α亚基及11S中的A3肽链与TG酶的作用关系最密切，其次是7S中β、γ亚基及11S中的A肽链，最后可能有关联的是11S中的B肽链。氨基酸含量分析，得到α’、α、β亚基及A、B肽链中赖氨酸摩尔百分比分别是8.19%、9.52%、6.33%、8.07%和3.65%，即大豆蛋白中亚基或肽链中的赖氨酸含量与TG酶作用关系密切，赖氨酸含量越高关系越密切。实验现象表明，适量TG酶可明显改善内酯豆腐的凝胶强度，本研究为实际生产中TG酶用于改善内酯豆腐品质提供参考。