柠檬烯纳米脂质体的制备及其性质测定

郝静梅，孙志高*，盛冉，方明，于奉生

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712) 2(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

柠檬烯又称苧烯，学名为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，分子式为C10H16，为无色至淡黄色的液体，不溶于水，溶于丙酮、乙醇等有机溶剂[1-2]，是自然界除蒎烯外分布最广的萜烯，具有抗菌、抗氧化、消炎和抗肿瘤等多种生理功能[3-5]。但是，由于柠檬烯不溶于水，且易于氧化和挥发，限制了柠檬烯在食品、药品、保健品等行业中的使用和发展。因此，为了更好地开发利用柠檬烯，研究改进柠檬烯溶解特性的新技术和方法极为迫切。

在20世纪60年代中期BANGHAM提出了脂质体由磷脂膜构成的概念,经过进一步发展，脂质体现已在药剂学、生物物理学、治疗物理学和化学等多个领域中广泛应用[6]。脂质体作为一种新型的靶向制剂，具有无毒、生物相容性好、可降解和缓释[7]，对脂溶性物质的包封性良好[8-9]等优点。采用脂质体技术将柠檬烯包封后可增加柠檬烯的稳定性，并提高柠檬烯的利用率。本研究通过利用乙醇注入法制备柠檬烯脂质体，以包封率为指标，通过单因素和响应面试验对柠檬烯脂质体的制备工艺进行优化，筛选出柠檬烯脂质体的最佳制备工艺，并测定了柠檬烯脂质体的平均粒径、粒径分布和电位等理化指标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬烯(纯度≥95%)，上海迈瑞尔化学技术有限公司；柠檬烯标准品(纯度≥99.0%)，美国Sigma公司；大豆卵磷脂(>90%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、三氯甲烷、甲醇、Na2HPO4、NaH2PO4均为分析纯，重庆川东化工有限公司；无水Na2SO4，成都科龙化工试剂厂；正己烷：色谱纯，Honeywell有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(BT224S)，赛多利斯科学仪器有限公司；恒温磁力搅拌器(DF-101S)，郑州长城科工贸有限公司；恒温水浴锅(LKTC-B1-T)，上海双舜实业发展有限公司；高速冷冻离心机(UniCen MR)，德国Herolab公司；涡旋混合器(XW-80A)，其林贝尔仪器制造有限公司；7890B/5977A气相色谱-单四级杆质谱联用仪、HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、G4513A自动进样器，美国Agilent公司；激光粒度分析仪(ZEN 3600)，英国Malvern仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乙醇注入法制备柠檬烯纳米脂质体

采用乙醇注入法制备柠檬烯脂质体，称取一定量的大豆卵磷脂、胆固醇，加入5 mL无水乙醇于50 ℃水浴充分溶解5 min，然后加入一定量的柠檬烯充分混匀，用注射器快速吸取上述脂质乙醇溶液，并匀速注入到不断搅拌的水化介质0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution, PBS)中，搅拌水化20 min后过0.22 μm的微孔滤膜，即得到柠檬烯脂质体[10, 11]。

1.3.2 GC-MS测定柠檬烯的含量

色谱条件：色谱柱为超高惰性HP-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；程序升温：起始温度40 ℃，停留1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，停留1 min，进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气，流速为1.2 mL/min，不分流，进样量为0.1 μL；用外标法自动进样器直接进样，分别测定不同浓度柠檬烯标准液的峰面积，绘制标准曲线。

质谱条件：EI离子源；电子能量70 eV；传输线温度为280 ℃；离子源温度为230 ℃；四级杆温度为150 ℃；质量扫描范围m/z为40～350。

1.3.3 标准曲线的绘制

取30 mg柠檬烯标准品于25 mL容量瓶中，用色谱级正己烷定容至25 mL，即可制备成1000 μg/mL的柠檬烯标准溶液，然后吸取1 mL上述标准溶液于10 mL容量瓶中，并用色谱级正己烷定容，制得100 μg/mL的柠檬烯标准溶液，再将其依次稀释成50、40、30、20、10、1 μg/mL的柠檬烯标准溶液。在1～100 μg/mL置信区间内以柠檬烯浓度为横坐标(X)、峰面积(Y)为纵坐标，绘制柠檬烯标准曲线。

1.3.4 柠檬烯纳米脂质体包封率的测定

游离柠檬烯含量的测定：吸取1 mL柠檬烯脂质体于10 mL离心管中，加入5 mL正己烷，旋紧瓶盖密封，漩涡混合15 s。然后于4 000 r/min离心20 min，分离水相和正己烷相，取上层正己烷相3 mL于10 mL离心管中，加入0.1 g已干燥的无水Na2SO4，并静置20 min，然后于10 000 r/min离心10 min，最后用气相色谱法测定游离的柠檬烯含量Q1。

破乳后全部柠檬烯含量的测定：吸取1 mL柠檬烯脂质体于10 mL离心管中，加入0.5 mL甲醇和三氯甲烷的混合物(甲醇的体积分数为50%)，旋涡混合3 min，然后再加入5 mL正己烷，旋紧瓶盖密封。将试管于50 ℃水浴中加热20 min，并不断振荡。加热后冷却，然后于4 000 r/min离心15 min ,分离水相和正己烷相，取上层正己烷相3 mL于10 mL离心管中，加入0.1 g已干燥的无水Na2SO4并静置20 min，然后于10 000 r/min离心10 min，最后用气相色谱法测定全部的柠檬烯含量Q2。

柠檬烯脂质体的包封率(encapsulation efficiency，EE)由公式(1)计算可得：

(1)

式中：Q1表示游离柠檬烯含量；Q2表示破乳后全部柠檬烯含量。

1.3.5 乙醇注入法制备柠檬烯纳米脂质体的工艺优化

以包封率为指标，首先对影响柠檬烯纳米脂质体包封率的大豆卵磷脂添加量(50、100、150、200、250、300 mg)、胆固醇的添加量(0、5、10、15、20、25 mg)、柠檬烯的添加量(5、10、15、20、25、30 mg)、磁力搅拌速度(200、400、600、800、1 000、1 200 r/min)、PBS缓冲液的温度(30、40、50、60、70、80 ℃)、PBS缓冲液的pH值(5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)等因素进行研究。在单因素实验的基础上，通过SPSS 20.0对实验数据进行显著性和极差分析，选取胆固醇添加量、柠檬烯添加量、PBS缓冲液的温度3个主要影响因素，采用响应面分析法优化柠檬烯脂质体的制备工艺，试验设计见表1。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 The factor and levels of response surfaceoptimization experiment

1.3.6 验证实验

根据优化后的最佳工艺，重新制备柠檬烯脂质体，对包封率进行测定，观察试验结果与模型符合情况。

1.3.7 柠檬烯脂质体粒径及电位的测定

以最佳条件下制备的柠檬烯脂质体作为样品，用马尔文Zetasizer Nano-ZEN 3600激光粒度仪在25 ℃测定其粒径及电位，设定的平衡时间为120 s、间隔时间为10 s，每次扫描3次，取其平均值[12]。

2 结果与分析

2.1 柠檬烯标准曲线

图1-a即为用1.3.2气相色谱质谱条件所得柠檬烯的气相色谱图。柠檬烯标准曲线如图1-b所示，柠檬烯浓度在1～100 μg/mL范围内具有良好的线性相关性。柠檬烯标准曲线回归方程为Y=46 000X+74 860，R2=0.999 0。

图1 柠檬烯标准品气相色谱图(a)及标准曲线(b)
Fig.1 GC chromatogram (a) and standard curve (b) of limonene standard

2.2 单因素试验

2.2.1 大豆卵磷脂添加量对柠檬烯脂质体包封率的影响

将大豆卵磷脂添加量设为50、100、150、200、250、300 mg，柠檬烯添加量为10 mg，PBS缓冲溶液温度为50 ℃，pH为7.0，磁力搅拌器速度为800 r/min，其包封率结果如图2-a所示。随着大豆卵磷脂添加量的上升，其包封率呈现先上升后趋于平稳的态势。当卵磷脂添加量较少时，不足以包封分散在体系中的柠檬烯，故包封率较低；随着添加量的上升，分散在体系中的卵磷脂足以包封体系中的柠檬烯，并逐渐饱和，当卵磷脂添加量过高时，体系呈乳白色，可能是有部分卵磷脂析出所致，综合考虑选择卵磷脂添加量为100 mg。

2.2.2 胆固醇添加量对柠檬烯脂质体包封率的影响

大豆卵磷脂添加量为100 mg，胆固醇添加量为0、5、10、15、20、25 mg，其他条件同2.2.1，包封率结果如图2-b所示。由图2-b可知，随着胆固醇含量的升高，包封率呈现先升高后降低的趋势。当大豆卵磷脂和胆固醇的质量比即膜材比为10∶1时，柠檬烯脂质体的包封率达到最大值(63.49±0.83)%。大豆卵磷脂是组成脂质体双分子层膜的主要成分，但仅有大豆卵磷脂制备的脂质体具有通透性，刚性不足，加入胆固醇可增加脂质体双分子层的刚性，具有调节脂质体膜流动性和稳定性的功能[13]。少量的胆固醇对柠檬烯脂质体的构建具有重要作用，胆固醇可以稳定柠檬烯脂质体的双分子结构，降低其流动性以及减少柠檬烯的泄漏[14]。但是胆固醇的添加量不宜过高，否则刚性增强，会形成结晶物，破坏脂质体的双分子层结构，导致柠檬烯泄漏，故包封率呈现先上升后下降的趋势[15-16]。

2.2.3 柠檬烯添加量对脂质体包封率的影响

将柠檬烯的添加量分别设为5、10、15、20、25、30 mg，胆固醇添加量为10 mg，其他条件同2.2.2，制备柠檬烯脂质体，其包封率结果如图2-c所示。由图2-c可见，随着柠檬烯添加量的增大，脂质体的包封率呈现先上升后下降的趋势，当柠檬烯的添加量为10 mg时，脂质体包封率达到(64.23±0.87)%的最高水平，但随着柠檬烯添加量的进一步升高包封率呈下降趋势。其原因为当溶质分子的浓度太低时，增加了脂质体在形成过程中对柠檬烯分子的“捕捉”难度[17-18]，导致包封率较低。随着柠檬烯添加量的进一步升高，推测由于一定量的磷脂所形成的脂质体对柠檬烯的包封能力是有限的，当柠檬烯含量超过脂质膜的饱和度[19]时，其包封率也会下降，故实验选取柠檬烯添加量为10 mg。

2.2.4 PBS的温度对柠檬烯脂质体包封率的影响

当柠檬烯添加量为10 mg，其他条件同2.2.3，改变PBS的温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃，制备柠檬烯脂质体，并测定脂质体的包封率。由图2-d可知，随着PBS缓冲液的温度升高，脂质体的包封率呈现先上升后下降的趋势，当PBS的温度为50 ℃时，包封率最高，为(65.69±1.06)%。因为每一种磷脂都有其自身的相变温度，它也是组成磷脂的酰基链由固态向液态过渡时的温度，磷脂膜的物理性质与其水化介质的温度密切相关，故必须使PBS的温度高于磷脂的相变温度，才能使脂质体在液晶条件下进行，但温度过高又会加速大豆卵磷脂的氧化及引起被包封物的氧化降解[19-20]。同时对于脂溶性物质，柠檬烯被包埋在脂质膜中，当PBS温度低于磷脂的相变温度时，柠檬烯无法进入到脂质双分子层中，导致包封率降低；但PBS温度过高，又会直接导致柠檬烯的挥发增强，损失增大，且膜的通透性也增加，导致柠檬烯的泄漏增加，故实验选择PBS温度为50 ℃。

2.2.5 磁力搅拌速度对柠檬烯脂质体的影响

将PBS温度设为50 ℃，其他条件同2.2.4，调整磁力搅拌器速度分别为：200、400、600、800、1 000、1 200 r/min，制备柠檬烯脂质体，并测定柠檬烯脂质体的包封率。由图2-e可知，随着搅拌速度的增加脂质体包封率处于先上升后逐渐稳定在一定范围内，当搅拌速度在600～1 200 r/min范围内，脂质体的包封率较高，其原因可能是因为磁力搅拌器的速度快慢直接影响体系内脂质的分散及水合[21]，当搅拌速度过慢时，PBS缓冲溶液不足以均匀分散磷脂乙醇溶液，使得包封率较低；随着搅拌速度加快，脂质体系分散较均匀，包封率随之提高，但若搅拌速度过快又易产生较多泡沫，综合考虑选择磁力搅拌速度为800 r/min。

2.2.6 PBS的pH值对柠檬烯脂质体包封率的影响

将搅拌速度设为800 r/min，其他条件同2.2.5，依次改变PBS的pH值为5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8，制备柠檬烯脂质体，并测定脂质体的包封率。由图2-f可以看出，随着PBS的pH值增大，其脂质体的包封率呈先上升后下降趋势。当PBS的pH值为7.4时，柠檬烯脂质体的包封率最高，为(66.49±0.53)%。由于脂质体的膜材选择为大豆卵磷脂，其中带有多种不同极性头部的杂质分子，因本身电荷的排斥和吸引而影响脂质体的稳定性。过酸或过碱均会使脂质体对H+或者OH-有较多的吸附而导致负荷过重，影响包封率[22]，故实验选取PBS的pH值为7.4。

图2 不同因素对柠檬烯脂质体包封率的影响
Fig.2 Effect of different factors on encapsulation efficiency of limonene liposomes

2.3 响应面实验结果

对表2中所得实验数据进行回归拟合，得到以包封率为目标函数的二次回归方程为：Y=66.05-1.96A+3.01B+1.16C-1.49AB-0.14AC-0.90BC-5.60A2-3.02B2-3.83C2，对该模型进行回归方差分析，结果见表3。模型p<0.000 1，表示模型极显著，该试验方法可靠；失拟项p=0.167 2>0.05，不显著，说明回归方程与实测值拟合较好。模型相关系数R2=0.978 6，说明该模型能较好地描述试验结果。因此可以用此模型来分析和预测柠檬烯脂质体的响应面工艺结果。由表3可知该模型中A、B、AB、A2、B2、C2达到极显著水平，C达到显著水平。3个因素对脂质体包封率的影响顺序为柠檬烯添加量>胆固醇添加量>PBS的温度。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangementand corresponding results

表3 响应面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for responsesurface quadratic model

注：p<0.05为显著水平，用“*”表示；p<0.01为极显著水平，用“**”表示。

2.4 响应面工艺优化分析

利用Design-Expert软件得出两两因素对脂质体包封率影响的响应曲面图和等高线图，如图3所示。图3-a曲线的陡峭程度最大，表示柠檬烯添加量、胆固醇添加量这2个因素对包封率的影响较大，这与单因素的实验结果相一致。随着柠檬烯添加量的变化，其响应面曲面较陡峭；随着胆固醇添加量的变化呈弧形，弧度较大，在两者交互作用中，柠檬烯的添加量占主导作用，且等高线呈现明显的椭圆形，表明两因素的交互作用明显[23-24]。同理，由图3-b可知,随着水合温度的变化，响应面曲面较为光滑，胆固醇添加量对脂质体包封率的影响更为显著，在两者的交互作用中占主导作用，但二者交互作用不显著。由图3-c可知柠檬烯添加量以及PBS缓冲液的温度，以及二者交互作用对柠檬烯脂质体包封率的影响。随着柠檬烯添加量的变化，其响应面曲面较陡峭；随着PBS缓冲液温度的变化，其响应面曲面较为平缓，弧度较小。柠檬烯在两者的交互作用占主导作用，二者交互作用不显著。根据模型所预测的最优工艺条件为：胆固醇添加量为8.75 mg，柠檬烯添加量为12.73 mg，温度为50.91 ℃，在此条件下所制备的柠檬烯脂质体的包封率为67.17%。

图3 两两因素交互作用对柠檬烯纳米脂质体包封率影响的响应面图和等高线图
Fig.3 Response surface and contour plots showing the pairwise interactive effects of different conditions on encapsulation efficiency of limonene nanolipsomes

2.5 验证实验

为了操作便利，将最佳条件调整为：胆固醇添加量为8.8 mg，柠檬烯添加量为12.7 mg，PBS温度为51 ℃，在此条件下进行3次平行实验，所得柠檬烯脂质体的平均包封率为(67.44±0.58)%，与理论预测值的相对误差为0.4%，直接反应了脂质体对柠檬烯的包封效果较好。

2.6 柠檬烯脂质体外观形态、粒径和Zeta电位检测

由图4-a可知，柠檬烯脂质体外观呈半透明状态，并伴有淡蓝色乳光。粒径尺寸以及分布通常作为衡量纳米脂质体稳定性的一个重要指标，PDI是指脂质体粒径的多分散性指数，PDI越小表示脂质体直径分散越均匀、集中，PDI数值在0～0.3之间表明体系具有均匀的分散性[25-26]。最佳工艺条件下制备的柠檬烯脂质体的平均粒径为(165.4±2.08)nm，平均多分散指数为(0.185±0.011)，这表明粒径均匀性良好。响应面工艺优化后所制得的柠檬烯脂质体，其Zeta电位为(-16.23±0.569)mV，见图4-c。Zeta电位越大表示脂质体双分子膜表面所带的电荷越多，聚集时所需要克服的静电斥力就越大，较大的Zeta电位可以阻碍脂质体溶液中的微粒发生凝聚[24, 27]。因此，综合分析粒径、PDI及Zeta电位，可以初步推测柠檬烯脂质体具有较好的稳定性。

图4 柠檬烯纳米脂质体的外观(a)、平均粒径(b)及Zeta电位(c)
Fig.4 The extrinsic feature(a)、particle size(b) and zeta potential (c) of limonene nanoliposome

3 结论

脂质体作为一种人工膜，既可包埋亲水性物质又可包埋疏水性物质，且安全、无毒副作用，具有良好的生物相容性[28]。本研究以乙醇注入法制备柠檬烯脂质体，并用响应面法进行优化得到最佳制备条件：胆固醇添加量为8.8 mg、柠檬烯添加量为12.7 mg、PBS缓冲溶液的温度为51 ℃，所制备的柠檬烯脂质体的包封率为(67.44±0.58)%，平均粒径为(165.4±2.08)nm，PDI为(0.185±0.011)，平均电位为(-16.23±0.569)mV。通过制备柠檬烯脂质体，不仅可以保护被包埋的柠檬烯，提高柠檬烯的稳定性，减少柠檬烯的挥发和氧化，更为柠檬烯在食品添加剂、药品、功能食品等领域的进一步研究和应用提供了可能性，具有重要的现实指导意义。