3，4⁃二羟基苯乙酮抑制NF⁃κB核转位减轻脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应

张代娟 刘江月 王建英

潍坊医学院病理生理教研室（山东潍坊261053）

动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎性疾病［1］。巨噬细胞参与了AS发生发展的整个过程（脂质条纹、斑块形成及破裂）。活化的巨噬细胞氧化活性增强，释放多种炎症介质，可通过胞内炎性信号通路扩大炎症反应。NF⁃κB的活化是一个中心环节。NF⁃κB核易位而具有活性，调控与AS炎症反应相关的多种因子的转录和表达，参与AS炎症反应［2］。因此，从不同环节寻找抑制NF⁃κB活性的药物，用于治疗和预防与NF⁃κB有关的疾病，是当前药物研究的热点。而挖掘祖国医学，从中草药及其提取物中开发价廉、服用方便且能有效防治AS发生发展的药物已凸显明显的优势。3，4⁃DHAP是从秃毛冬青叶中提取的单体成分，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒等作用［3］。本课题组前期研究发现3，4⁃DHAP能抑制巨噬细胞的炎症反应［4］，并降低兔血浆TNF⁃α及减少兔AS斑块中VCAM⁃1的表达，具有抗炎作用［5］。但其抗炎机制尚不明确，目前国内外研究较少。因此，本研究以NF⁃κB信号通路为切入点，以巨噬细胞为研究对象，探讨3，4⁃DHAP抗炎的可能机制，有助于我们更全面地了解3，4⁃DHAP药理机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂RAW264.7购自中国科学院上海细胞所；3，4⁃DHAP（纯度99.9%）日本TCI，批号：D2345⁃5G。LPS、Western blot相关试剂（SANTA CRUZ）；TNF⁃α、VCAM⁃1 ELISA试剂盒及一抗（武汉博士德生物工程有限公司）；IκB qRT⁃PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），P⁃IκB、IκB多克隆抗体（美国RabMAb公司）；NF⁃κBp65多克隆抗体（美国Abcam公司）。

1.2 主要仪器CO2培养箱（美国Thermo Forma公司）；DYCZ⁃25D型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Bio⁃Rad湿转仪、CFX96TMReal⁃Time PCR 仪（美国Bio⁃Rad公司），凝胶成像分析仪（美国Biorad公司）。

1.3 细胞培养及分组37℃、5%CO2培养箱，DMEM培养基传代培养RAW264.7细胞。随机分为正常组（A）、LPS组（B）、3，4⁃DHAP组（C）、辛伐他汀组（D）。LPS终浓度10 ng/mg，3，4⁃DHAP终浓度10⁃7mol/L，辛伐他汀终浓度10-7mol/L［6］。LPS 刺激8 h后［6］，收集细胞及上清液。

1.4 ELISA检测TNF⁃α、VCAM⁃1的水平采用双抗体夹心法，按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 qRT⁃PCR检测IκB mRNA表达收集处理后的细胞，提取总RNA，去除基因组DNA后进行RNA逆转录反应，以β⁃actin为内参进行RT⁃PCR反应，计算目的RNA的相对表达量，引物设计见表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

1.6 Western blot检测P⁃IκB、IκB及NF⁃кB P65蛋白的表达收集处理后RAW264.7细胞，提取总蛋白，SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白后切取目的条带，以湿转法进行转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加Ⅰ抗（1：500），4℃过夜，TBST漂洗3× 15 min，加入Ⅱ抗孵育1 h，TBST漂洗3×15 min，ECL化学发光，暗室曝光显影，图像分析。

1.7 Western blot检测细胞核内NF⁃кB P65蛋白表达参照文献［7-8］报道的方法提取核蛋白，Western blot法同上。

1.8 统计学方法实验数据以表示，应用SPSS 18.0统计学软件进行分析，采用单因素方差分析，组间比较用LSD检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF⁃α、VCAM⁃1的分泌与A组比较，B组TNF⁃α、VCAM⁃1分泌显著增多（P＜ 0.05）；与B组比较，C、D 组TNF⁃α、VCAM⁃1分泌均显著减少（P＜0.05），且C组较D组减少显著（P＜0.05），说明3，4⁃DHAP对LPS诱导RAW264.7细胞TNF⁃α、VCAM⁃1分泌有明显的抑制作用，且作用效果优于辛伐他汀（图1）。

图1 TNF⁃α、VCAM⁃1的分泌Fig.1 The secretion of TNF⁃α and VCAM⁃1

2.2 IκB、P⁃IκB蛋白的表达与A组比较，B组P⁃IκB/IκB比值显著增加（P＜ 0.05）；与B组比较，C、D组P⁃IκB/IκB比值均明显减少（P＜ 0.05），且C组较D组减少明显（P＜0.05），说明3，4⁃DHAP对LPS诱导RAW264.7细胞IκB蛋白磷酸化有明显的抑制作用，且作用效果好于辛伐他汀（图2）。

2.3 IκB mRNA的表达与A组比较，B组IκB mRNA表达显著减少（P＜0.05）；与B组比较，C、D组IκB mRNA表达均明显增加（P＜0.05），且C组较D组表达更加显著，差异有显著性（P＜0.05），说明3，4⁃DHAP促进LPS诱导RAW264.7细胞IκB mRNA表达，且作用效果优于辛伐他汀（图3）。

图3 IκB mRNA 的表达Fig.3 The expression of IκB mRNA

2.4 NF⁃κBp65蛋白核转位与A组比较，B组细胞核内NF⁃κB蛋白表达明显增多（P＜0.01）；与B组比较，C、D组细胞核内NF⁃κB蛋白表达均显著减少，且C组较D组减少更为明显，差异有显著性（P＜0.05），说明 3，4⁃DHAP抑制 LPS诱导RAW264.7细胞NF⁃κB核转位，且作用效果优于辛伐他汀（图4、5）。

图4 细胞核NF⁃κBp65蛋白表达Fig.4 The expression of nuclear NF⁃κBp65 protein

3 讨论

AS是众多心脑血管疾病共同的基本病理过程，对人类健康造成严重危害，寻找有效防治药物已成为医药界的重要任务。巨噬细胞是动脉粥样硬化病变的主要细胞，是动脉粥样硬化病变进展的一个特征。活化的巨噬细胞释放多种炎症介质，扩大炎症反应，推动动脉粥样硬化的发展［9］。3，4⁃DHAP是本课题组致力研究多年的一种药物。本研究通过LPS诱导RAW264.7细胞发现上清液中TNF⁃α、VCAM⁃1水平均明显升高，而3，4⁃DHAP对TNF⁃α、VCAM⁃1分泌有明显的抑制作用，说明3，4⁃DHAP可以抑制活化的巨噬细胞所介导的炎症反应，这与本课题组在前期工作中发现 3，4⁃DHAP 具有抗炎作用的结果［4］是一致的。

图5 细胞质NF⁃κBp65蛋白表达Fig.5 The expression of cytosolic NF⁃κBp65 protein

研究表明，NF⁃κB信号通路参与慢性炎症的反应过程，如动脉粥样硬化、风湿性关节炎等［10］。NF⁃κB是一种重要的核转录因子，对多种促炎症细胞因子、黏附分子、趋化因子的表达起着关键的调控作用［11］。例如 IL⁃1，6，8，TNF⁃α，ICAM⁃1，VCAM⁃1等，这些基因的启动子和增强子中存在一个或多个κB序列，因此，NF⁃κB的激活是这些基因活化的前提，是形成AS的前提［12］。IκB激酶是NF⁃κB核转位的关键酶，在正常细胞中，NF⁃κB与抑制因子IκB结合以无活性的状态存在于细胞浆中，当细胞受到氧化应激等因素刺激时，IκB磷酸化降解，NF⁃κB迅速从细胞浆易位到细胞核，与相应基因的κB位点结合，上调这些基因的转录活性及蛋白表达［13］。YU等［14］研究发现抑制NF⁃κB活性可明显降低LPS诱导RAW264.7细胞TNF⁃α、IL⁃1的表达。李旎等［15］研究发现抑制IκB磷酸化，下调NF⁃κB活性，能明显减少LPS诱导RAW264.7细胞TNF⁃α分泌。本研究发现LPS诱导RAW264.7细胞核内NF⁃κB蛋白含量明显增多，3，4⁃DHAP干预后，IκB蛋白表达显著增加，细胞核内NF⁃κB蛋白含量明显减少，表明NF⁃κB核转位明显受到抑制，同时上清中TNF⁃α、VCAM⁃1水平显著降低，表明抑制NF⁃κB核转位可减轻炎症反应，与前人的研究结果一致。

总之，本研究证实了3，4⁃DHAP对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF⁃α、VCAM⁃1具有明显的抑制作用，3，4⁃DHAP通过抑制NF⁃κB核转位，有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应。

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