GC-MS法建立血液、尿液中安定类药物的定性、定量检测方法及应用

阿力亚·阿西木， 尔西丁·买买提， 孙力扬， 艾克拜尔·热合曼

(新疆医科大学1公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室, 2基础医学院法医教研室， 乌鲁木齐 830011)

近几年来，随着现代社会发展速度的加快，生活压力越来越大，抑郁、失眠、焦虑、神经紧张的等亚健康状态越来越常见。一项调查表明，国外成年人中50%～60%人的睡眠质量很差，而我国睡眠障碍发生率也在40%左右并具有越来越年轻化的趋势[1]。轻度的睡眠障碍可采用改善睡眠环境和作息时间，以及调整饮食习惯等心理和行为治疗；严重的睡眠障碍可选用药物治疗，当前临床上安定类药物以高效、安全、耐受性好等优点普遍被首选用在针对失眠、焦虑等症状的治疗[2]。

本研究常见的安定类药物主要有阿普唑仑，溴安定，氯硝西泮，地西泮等14种。此类药物在临床上普遍用来催眠、镇定、抗焦虑、抗惊厥以及抗精神失常[3-6]。不合理用药可致呼吸麻痹死亡，正因如此，临床不合理用药，误用或误服导致的安定类药物中毒的报道越来越常见，某些自杀或投毒抢劫案件也经常涉及到安定类精神类药品[7]。因此，建立精神类(安定类)药物的快速、准确地筛选和确证的检测分析方法在临床诊断和司法鉴定领域中非常必要[8]。

由于血液、尿液等生物检材中药物浓度随着时间及代谢逐渐降低，难以检出[9]。目前，安定类药物的检测方法主要有气相色谱法(Gas Chromatography，GC)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、液相色谱-质谱联用法(Liquid Chromatography-Mass spectrograph，LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(Gas Chromatography-Mass spectrograph，GC-MS)等[10-11]，本研究尝试应用被普遍认为法医鉴定中的金标准GC/MS法对血液、尿液中安定类药物进行定性定量分析[12]。

1 材料与方法

1.1仪器与试药

1.1.1 仪器气相色谱/质谱联用仪(气相色谱为Agilent 7890B，质谱为Agilent 5977A)，TDL-508型离心机(上海安亭科学仪器厂)，HGC-12A型静音无油空压机(天津恒高科技有限责任公司)，XH-J型振荡器(金坛市医疗仪器厂)，AB135-S型电子分析天平(瑞典，METTLER TOLEDD)，气质联用仪色谱柱子(HP-5MS，Agilent)，固相萃取微型小柱(SPE，BOND ELUT-CERTIFY,VARIAN公司)。

1.1.2 试药 安定类药物标准品：阿普唑仑(批号A903)、氯氮卓(批号C022)、氯硝西泮(批号C907)、地西泮(批号D907)、咪达唑仑(批号M908)、硝西泮(批号N906)、奥沙西泮(批号O902)、普拉西泮(批号P906)、替马西泮(批号T907)、三唑仑(批号T910)、去甲地西泮(批号N905)、溴安定(批号B903)、劳拉西泮(批号L901)、氟硝西泮(批号F907)等标准样品(液体)通过乌鲁木齐市公安局刑科所购买于Sigma公司，浓度均为1 mg/mL；SKF-525 a(纯度97%，粉末状，用于内标，批号P1061)，公安部物证鉴定中心提供；甲醇、乙酸乙酯、丙酮等均为色谱纯试剂；盐酸、氨水、二氯甲烷为分析纯试剂；实验室自配的0.1 mol/mL pH=6.0磷酸缓冲液和pH=9.18的硼砂缓冲液；Bond Elut Plexa固相萃取小柱(130 mg，3 mL)，购自Varian公司。

1.2标准品与内标溶液的配制

1.2.1 标准品溶液的配置 阿普唑仑、氯氮卓、氯硝西泮、地西泮、咪达唑仑、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、替马西泮、三唑仑、去甲地西泮、溴安定、劳拉西泮、氟硝西泮等标准品浓度均为1.0 mg/mL。将各标准品分别放入已标记编号的10 mL干净容量瓶并加甲醇稀释到刻度位置，即配置浓度为100 μg/mL的标准品储备液。从各储备液中取100 μL分别放入的进样瓶中添加甲醇900 μL稀释至1 mL，获得浓度为10 μg/mL各标准品的储备工作溶液。再次从各10 μg/mL储备液稀释得到浓度为1 μg/mL工作溶液，封口，放在4℃冰箱保存。

1.2.2 内标溶液的配置 准确称取20 mg普罗地芬盐酸盐(SKF-525a)作为内标，放入10 mL容量瓶中并用甲醇溶解准备浓度为2 mg/mL的内标母液。用移液枪移取20 μL母液放入进样瓶中加980 μL甲醇稀释准备1 mL 40 μg/mL的内标工作液，再度稀释制备4 μg/mL的内标溶液，放置4℃冰箱保存。

1.2.3 标准曲线溶液的配制将无任何服用安定类药物史的志愿者血液和尿液作为空白血液和尿液，用于制备标准系列溶液绘制标准曲线。血液：针对每一种安定类药物制备6个离心管，进行编号。分别加入2 mL空白血液，每份样品添加50 μL浓度为4 μg/mL内标溶液。已添加内标溶液的第一份血样作为空白对照样不添加标准品溶液，从第二份血样开始每份样品中加入适量的1 μg/mL的14种安定类药物的标准品溶液配制浓度为10、20、40、80、200 ng/mL的阿普唑仑、溴安定、咪达唑仑、去甲地西泮；浓度为2、5、20、50、100 ng/mL的氯硝西泮、普拉西泮；浓度为20、50、100、200、400 ng/mL的氯氮卓、地西泮、奥沙西泮、替马西泮；浓度为1、2、10、20、40 ng/mL的氟硝西泮、三唑仑；浓度为5、10、20、50、100 ng/mL的硝西泮、劳拉西泮标准系列溶液。尿液：同样对每一种安定类药物制备6个离心管，进行编号。分别加入2 mL空白血液，每份样品添加50 μL浓度为4 μg/mL内标溶液。已添加内标溶液的第一份尿样作为空白对照样不添加标准品溶液，从第二份血样开始每份样品中加入适量的1 μg/mL的14种安定类药物的标准品溶液配制浓度为10、20、40、80、200 ng/mL的阿普唑仑；浓度为20、50、100、150、300 ng/mL的溴安定、氯硝西泮；浓度为20、50、100、200、400 ng/mL的氯氮卓、地西泮、奥沙西泮、替马西泮；浓度为5、10、20、50、100 ng/mL的氟硝西泮、劳拉西泮、硝西泮、普拉西泮；浓度为10、20、50、100、200 ng/mL的咪达唑仑；浓度为10、25、50、100、200 ng/mL的去甲地西泮、三唑仑标准系列溶液。

1.3样品的制备

1.3.1 血样的前处理 准确移取2 mL血样置于15 mL离心试管中，添加约30 mg 碳酸铵，调节pH值约为8，滴加4 mL乙酸乙酯(与样品比值2∶1，需要注意的是滴加过程中试管必须始终保持震荡状态)，以4 000 r/min转速离心10 min，将上层有机相转移过滤至已经标签好的10 mL试管中用氮吹仪吹干，最后加2 mL pH=9.5的缓冲溶液溶解。此溶液将进一步过固相萃取柱子。

1.3.2 尿样的前处理 准确移取2 mL尿样(待测样或空白尿样)置于15 mL离心试管中，标准品溶液和内标溶液的添加方式和量与血样的前处理一致，各样品中再加入2 mL β-葡萄糖苷酸酶，震荡，摇匀；放在65℃水浴箱中水解3 h，再以4 000 r/min转速离心10 min，将上层有机部分转移并过滤至已经标签好的安瓿瓶中待进一步过固相萃取柱子。

1.3.3 固相萃取(SPE) (1)活化SPE柱子：首先用2 mL甲醇溶剂添加SPE柱子中，加2 mL纯水(去离子水)淋洗活化柱子。(2)SPE柱子中填充样品：将方法“1.3.1”和“1.3.2”项中前处理过的血样或尿样加入SPE柱子中，以1 mL/min流速过滤样品溶液。(3)洗涤SPE柱子：先用2 mL去离子水淋洗，然后用2 mL甲醇：纯水(20∶80)混合液洗涤，减压抽干2 min。(4)萃取提取：添加1 mL甲醇溶液加入抽干的柱子中并将目标物洗脱于2 mL安瓿瓶中。(5)吹干提取液：将安瓿瓶中的2 mL洗脱液置于氮吹仪上吹干。(6)定容：添加50 μL乙酸乙酯定容。(7)准备进样瓶：溶液移入内有200 μL内插管的2 mL进样瓶中，进行气相色谱-质谱法分析。

1.4气相色谱-质谱联用仪条件气相色谱条件为：色谱柱为Agilent HP-5MS,(30 m×0.250 mm×0.25 μm)，载气：高纯氦气(He),流速1.0 mL/min；程序升温模式：柱温60℃(恒温)，保持1 min，再以30℃/min速度升到235℃(程温)，保持5 min；再以20℃/min速度升到290℃，进样口温度：250℃；检测器温度：300℃。质谱条件为：EI离子源，电子能量70ev，离子源温度230℃。调谐方式为自动调谐，倍增电压1 073 v，发射电流100 μA，扫描范围50～500 m/z。

1.5方法学考察

1.5.1 线性关系的测定 按照“1.2.3”所采用的方法对空白尿样和空白血样中添加内标溶液和浓度呈梯度的标准溶液，用前处理方法对空白对照样和系列标准溶液进行处理和GC-MS检测信号强度(峰面积)。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，运用最小二乘法原则进行回归运算，求得直线回归方程和线性范围,见表1。

2 结果

2.114种安定类药物的结构式、保留时间和离子质荷比(m/z) 氯氮卓、地西泮、劳拉西泮、去甲地西泮、奥沙西泮等安定类药物若采用普通常温温度程序进行分离，以上几种成分色谱保留时间差距极微，即分离度较差，需按本文提出的色谱条件进行了优化，14种安定类药物具有比较好的分离度。14种安定类药物的化学结构式、分子量和EI全扫描质谱见图1，14种安定类标准物的色谱图见图2。14种安定类药物的保留时间和特征性离子质核比见表2。

表1 血样和尿样的回归方程及线性范围

表2 14种安定类药物的特征离子质核比、保留时间、最低定量限(LOQ)以及最低检出限(LOD)

2.2平均回收率、准确度和精密度的测定按照样品前处理方法操作处理后用GC-MS检测出来的检测量、峰面积比值与加入量比较，重复以上实验步骤3次，测定检出量计算其回收率、SD、RSD等相关指标。血液中各安定类药物的平均回收率、SD、RSD范围分别是在96.63～103.06、0.04～6.92、0.33%～8.16%。尿液：按照样品前处理方法操作处理后用GC-MS检测出来的检测量、峰面积比值与加入量比较，重复以上实验步骤3次，测定平均检出量计算其平均回收率、RE、RSD等相关指标。尿液中14种安定类药物平均回收率、准确度、精密度范围是在93.75～100.79、0.04～3.56、0.28%～10.13%，见表3。

2.3案件样品的含量测定2017年5月，乌鲁木齐市某区公安局发现一具不明原因死者尸体，死者李某，男，怀疑为吸毒死亡。经过对公安局送来的死者尿样利用已建立好的前处理方法(在碱性条件下水解后固相萃取SPE法提取)，分离、提取后，采用GC-MS仪SIM模式进行检测，尿液检出含量为0.34 μg/mL的地西泮与含量为1.5 μg/mL的代谢物去甲地西泮。检测结果表明，本方法适合于安定类药物及代谢物在各类案件中的定性定量要求。图3为案件尿液中检出的地西泮和去甲地西泮的SIM模式总离子流图。

表3 血液和尿液中14种安定类药物的回收率、R.E以及RSD

1:硝西泮；2:奥沙西泮；3:劳拉西泮；4:地西泮；5:氯氮卓；6:去甲地西泮；7:咪达唑仑；8:氟硝西泮；9:普拉西泮；10:氯硝西泮；11:溴安定；12:替马西泮；13:三唑仑；14:阿普唑仑

图214种安定类标准物的色谱图

3 讨论

3.1质谱条件的优化安定类药物是属于极性分子，而且分子量较大，因此以极性较弱的HP-5MS型毛细管柱子作为GC-MS仪柱子，采用全扫描(Full Scan)模式和选择离子(SIM)模式进行测试，将14种待测物的保留时间和特征离子质谱图进行对比定性分析。选择离子模式检测灵敏度更高，可做定量分析，对每一种标准品选择了4个特征离子(m/z)，根据同一个保留时间内出现的4个特征离子峰重叠性来定性标准品，为此不但可以降低混合物质的影响，而且在相同的扫描速度下，既增多了扫描次数，也提高了准确度、精密度以及灵敏度。

3.2SPE条件SPE法常用于比较难处理的血液、尿液等生物样品所包含的碱性或者酸性毒品成分的萃取。为确保对安定类药物14种类型均有效，并提高检测灵敏度，本实验的前处理使用Agilent Bond Elut Certify固相萃取小柱，结果较为满意。因此按照标准浓度配好的目标物运用混杂物质对检测结果的影响较小的GC-MS法检测并获得了较好的实验数据。

3.3工作曲线线性范围的选择和LOD与LOQ的制定本文中的工作曲线(回归曲线)线性范围是根据待测物浓度范围、药物中毒范围、临床上发挥药理作用的血药浓度范围，再结合运用的仪器条件来确定[13]。安定类药物最低检出限和最低定量限范围在血液和尿液中的存在一定的差异，在血液中的最低检出限在1～20 ng/mL内，最低定量限范围则是在2～50 ng/mL内；而安定类在尿液中的最低检出限在2～10 ng/mL内，最低定量限在10～50 ng/mL内，均低于药物的治疗浓度，足以满足法医毒物学分析、公共卫生突发事件和临床毒物学检测中毒或治疗浓度的需要[14]。

本文建立了对14种常见安定类药物进行有效分离、提取并GC-MS定性定量分析方法。通过应用在实际案件中验证此方法，为后期滥用安定类人员的治疗与司法鉴定工作提供有效实验数据和辅助依据。

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