睡莲花isostrictiniin对CCl4致小鼠急性肝损伤防护作用及其体外抗氧化活性研究

麦尔旦·吐尔逊麦麦提，刘 涛，李晨阳，徐 芳，赵 军

(新疆医科大学1药学院， 2公共卫生学院，乌鲁木齐 830011；3新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药重点实验室， 乌鲁木齐 830004)

睡莲花为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要生长在我国新疆阿勒泰、博湖及伊犁等地区[1]，具有降热止咳、益心护脑、安神止痛之功效，临床多用于治疗感冒发烧、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2,3]。睡莲花中主要化学成分为多酚类和黄酮类化合物，其中烟花苷、isostrictiniin等化合物是含量较高的特征性成分。本课题组前期研究表明睡莲花总黄酮提取物及其黄酮类成分烟花苷具有较好的保肝作用[4-6]。本研究采用体外抗氧化活性实验以及四氯化碳(CCl4)致小鼠急性化学性肝损伤模型来评价睡莲花中isostrictiniin的生物活性，为揭示睡莲花的药效物质基础提供理论依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器BS-450型自动生化分析检测仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)；UV-754型紫外可见分光光度仪(上海菁华科技仪器有限公司)；RT-6100型酶标仪(深圳雷社生命科学有限公司)；TGL-16M型冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；HH型恒温水浴锅(金坛科析仪器有限公司)。

1.2试剂联苯双酯滴丸(北京协和制药厂，批号0505010r7)；四氯化碳(天津永晟化学试剂厂，批号20151101)；总蛋白定量(BCA法)、MDA、SOD、GSH和NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20151219、20151207、20150610、20151112、20150605)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美国Sigma公司，批号：STBC5116V)；其它试剂均为分析纯。

1.3实验动物SPF级昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，购自新疆医科大学实验动物中心，合格证号SYXK(新)2011-0001，使用许可证号SYXK(新)2011-0001。

1.4药材睡莲花药材购自新疆维吾尔药业有限公司，经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾。

2 方法

2.1isostrictiniin的提取方法称取睡莲花药材10.0 kg，以10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液减压浓缩至浸膏。浸膏以水混悬后上D101型大孔吸附树脂柱，先以10倍量去离子水洗脱，再以5个柱体积的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至浸膏。将浸膏以适量甲醇溶解，聚酰胺拌样，上聚酰胺柱，用不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，收集60%乙醇洗脱溶液，减压浓缩干燥得浸膏，浸膏以水溶解后经MCI gel CHP 20P柱反复纯化，得到白色粉末，即isostrictiniin，经高效液相色谱归一化法测定其纯度为98.7%。

2.2isostrictiniin的抗氧化能力测定

2.2.1 铁离子还原能力的测定[7]在具塞试管中分别先后加入磷酸缓冲溶液(pH=7.4)2.5 mL、isostrictiniin(10、20、30、40、50 μg/mL)1.0 mL和1%铁氰化钾溶液1.0 mL，混合均匀；反应20 min(50℃恒温)后，室温冷却，分别加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL和蒸馏水4.0 mL后，再加入1.0 mL的0.1%三氯化铁溶液，混匀。对照组加入同浓度的Vc代替isostrictiniin溶液。静置10 min后，测定700 nm处吸光度。

2.2.2 DPPH·的清除能力测定 将不同浓度的isostrictiniin溶液(5、10、20、30、40、50、70、100 μg/mL)0.5 mL加入到2.5 mL浓度6.5×10-5mol/L DPPH溶液中，混匀。对照组加入同浓度的Vc代替isostrictiniin溶液。静置15 min，测定517 nm处吸光度，计算DPPH清除率及IC50值。清除率(Y)按下式计算：Y=[1-(Aj-Ak)/Am]×100%(式中Am、Aj、Ak分别为DPPH乙醇溶液与水混合液、试样混合液和DPPH乙醇溶液、试样混合液和乙醇溶液在517 nm处的吸光度值)[8]。

2.2.3 总抗氧化能力测定(FRAP法) 取浓度为300 mmol/L pH=3.6的醋酸盐缓冲液25 mL，加入浓度为 10 mmol/L 的TPTZ溶液2.5 mL，再加入浓度为 20mmol/L 的FeCl3混合溶液2.5 mL，混匀即得FRAP工作液。分别移取 0.1、0.2、0.3、0.4和0.6 mmol/L的FeSO4溶液 0.2 mL于反应管中，先后加入6.0 mL FRAP工作液和0.6 mL 蒸馏水，37 ℃下水浴10 min，在593 nm处测定吸光度A，以吸光度值A为纵坐标，FeSO4溶液(mmol/L)为横坐标，绘制标准曲线。在0.1～0.6 mmol/L范围内FeSO4的浓度与吸光度呈线性关系，线性回归方程为:Y=1.607 8X+0.057 5 (r=0. 999)。分别准确移取0.5 mL不同浓度的isostrictiniin溶液和Vc溶液(10、20、30、40、50 μg/mL)于反应管中，加入6.0 mL FRAP工作液和0.6 mL去离子水，混合均匀，10 min在37 ℃的条件下反应后用紫外在593 nm处测定吸光度A。根据A值，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(mmol/L)，即FRAP 值[9]。将样品溶液和对照溶液的A值代入FeSO4标准曲线方程，计算得 FRAP值(mmol/ L)。得到的 FRAP值(mmol/ L)为纵坐标，样品溶液和对照溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，绘制曲线，进行比较。

2.3Isostrictiniin对CCl4致小鼠急性肝损伤的防治作用

2.3.1 CCl4致小鼠急性肝损伤模型的建立及给药 根据文献[10]的方法将昆明种小鼠60只，根据体质量随机分为isostrictiniin低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg)、正常对照组、模型组和联苯双酯对照组(150 mg/kg体质量)。isostrictiniin组和联苯双酯对照组每日1次按体质量0.1 mL/10 g灌胃给药，其余组的小鼠每日1次按体质量0.1 mL/10 g灌胃去离子水，7 d连续地灌胃。最后1次给药后，除花生油溶液(0.1 mL/10 g体质量)注射空白组小鼠的腹腔外，其余各组小鼠腹腔均注射0.1% CCl4花生油溶液(0.1 mL/10 g体质量)。禁食不禁水8 h后，摘眼球取血，放置2 h后，3 000 r/min离心10 min，吸取血清备检各项生化指标。脱颈处死小鼠，取小鼠肝脏和脾脏，称重，计算肝脏(或脾脏)指数：脏器系数=脏器湿重(mg)/小鼠体质量(g)。精确称取0.5 g肝脏置于冷生理盐水中，用滤纸把水分吸干后，按1∶9(质量体积比)加入生理盐水4.5 mL，冰浴研磨至混浊的浆状，3 000 r/min离心10 min，取肝匀浆上清液检测生化指标。

2.3.2 生化指标检测 采用全自动生化仪测定血清ALT和AST水平；按试剂盒说明书检测肝匀浆MDA、SOD、GSH和NO含量。

2.3.3 病理学检查 小鼠处死后，取肝脏左叶距边缘0.5 cm处的小块组织，10%甲醛溶液中固定，HE染色法制作切片，40×10倍光镜下观察肝组织病理学变化。

3 结果

3.1isostrictiniin的抗氧化能力

3.1.1 isostrictiniin对铁离子的还原能力 随着isostrictiniin和Vc的浓度在(10 ～50 μg/mL)范围内增大，其吸光度值不断增加，对Fe3+还原能力不断增强，呈现出良好的剂量效应依赖关系，且isostrictiniin的还原能力强于Vc，见图1。

3.1.2 isostrictiniin对DPPH·的清除能力 Isostrictiniin对DPPH有较强的清除作用，与Vc的清除作用相等，并且呈现出的量效关系也良好，isostrictiniin与Vc的IC50值分别为8.95和6.33 μg/mL，见图2。

3.1.3 isostrictiniin的总抗氧化能力 FRAP值随样品浓度变大而变大，总抗氧化能力也变强。Isostrictiniin的总抗氧化能力与相同浓度下Vc的总抗氧化能力较当，见图3。

3.2isostrictiniin对CCl4致小鼠急性肝损伤的防护作用与空白组比较，CCl4导致的急性化学性肝损伤的小鼠血清中ALT和AST活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，isostrictiniin中、高剂量组(50、100 mg/kg)小鼠血清中ALT和AST水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且效果优于阳性对照联苯双酯。CCl4导致的肝损伤小鼠的肝脏指数和脾脏指数升高，isostrictiniin中、高剂量组小鼠肝脏指数和脾脏指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

3.3Isostrictiniin对CCl4致急性肝损伤小鼠肝匀浆MDA、SOD、GSH和NO的影响与空白组比较，模型组小鼠肝匀浆的MDA和NO水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；SOD和GSH水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，isostrictiniin中、高剂量组(50、100 mg/kg)小鼠血清MDA和NO水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)；小鼠血清SOD和GSH水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且效果接近于阳性对照联苯双酯，见表2。

表1 isostrictiniin对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST及肝脏、脾脏指数的影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2 Isostrictiniin对CCl4致急性肝损伤小鼠肝匀浆MDA、SOD、GSH和NO的影响

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01.

3.4isostrictiniin对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织病理形态学的影响正常对照组小鼠肝脏组织细胞的结构清楚，肝小叶的结构完整，肝脏组织细胞索的排列方式是呈放射状(图4A)。模型组小鼠的肝脏组织细胞有水肿、细胞质变疏松，呈气球样变，也能看到紊乱的肝脏细胞索排列，并且肝脏组织细胞脂肪的变性也可多见、碎片状和点状坏死等，且可见大量炎性细胞浸润(图4B)。联苯双酯对照组小鼠肝脏组织细胞水肿不明显，汇管区有少量浸润的炎细胞，有很少的点状坏死(图4C)。与模型对照组比较，isostrictiniin不同剂量组有效地改善了CCl4致导的急性肝损伤小鼠肝脏组织细胞的病变程度，其中高剂量组(100 mg/kg，图4D)小鼠肝脏病理组织的改善明显，肝脏细胞水肿减轻，坏死的肝脏细胞数量减少，变性的肝脏细胞脂肪数少，偶见浸润的炎性细胞，肝小叶结构基本完整，见图4。

A.空白组

B. 模型组

C. DDB (150 mg/kg)

D. isostrictiniin (100 mg/kg)

E. isostrictiniin (50 mg/kg)

F. isostrictiniin (25 mg/kg)

图4Isostrictiniin对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织病理切片的光镜观察(HE染色,×400)

4 讨论

铁离子还原能力、DPPH·清除实验以及FRAP法是抗氧化活性成分筛选的常用方法。本研究结果显示isostrictiniin具有较好的总抗氧化能力、铁离子还原能力及DPPH·清除能力，其抗氧化活性几乎与Vc相当。CCl4作为是一种对肝细胞有严重毒性的化学物质，CCl4致肝损伤的机制与其自身及代谢产物有关。在肝组织内细胞色素P450作用下，CCl4代谢产生三氯甲烷自由基-CCl3。-CCl3刺激细胞产生活性中间产物，造成脂质过氧化，并与肝细胞蛋白或DNA结合破坏肝细胞机能，造成生物膜结构和功能损伤，从而导致肝细胞损伤坏死，胞内的转氨酶ALT、AST溢出，使血浆ALT、AST升高[9]。此外，CCl4自身的溶酶作用也可导致肝细胞损伤。CCl4在小鼠肝脏导致急性化学性损伤后，血清中ALT、AST的水平升高。预先给予isostrinctiniin(50、100 mg/kg)后，与模型组相比，小鼠血清中ALT、AST水平明显降低，肝脏、脾脏指数下降，小鼠肝脏的病理损伤程度得到改善。此外，isostrictiniin各给药组可提高SOD和GSH的活性，降低NO含量。中高剂量组的isostrictiniin还能降低MDA的含量。上述数据表明isostrictiniin有保肝降酶作用，还可抑制肝组织脂质过氧化反应，提示其作用机制可能与其抗氧化作用有关，对睡莲花药效物质基础的揭示及开发提供了理论依据。

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