MCP2促进食管癌细胞迁移和侵袭的实验研究

卢晓梅， 周 剑,， 郑树涛， 刘 涛， 刘 清， 马 蓉,， 谭豆豆， 陈玉梅

(新疆医科大学1附属肿瘤医院； 2临床医学研究院， 乌鲁木齐 830011)

食管癌是我国十大恶性肿瘤之一，食管癌的发病率和致死率在我国恶性肿瘤中分别居于第5位和第4位[1]。食管癌的组织学类型包括鳞状细胞癌和腺癌，我国90%的食管癌属于食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。食管癌的病因复杂，遗传和环境因素、饮食与生活习惯等都是食管癌发病的潜在危险因素[3]。近年来研究发现，肿瘤微环境中的趋化因子可通过与肿瘤细胞的相互作用，在肿瘤进展过程中起着重要作用[4]。

趋化因子是一种小分子低重量蛋白，可以结合特殊的G蛋白偶联于细胞表面受体。趋化因子在肿瘤生长、侵袭转移及免疫反应中起着重要作用[5-6]。巨噬细胞趋化蛋白2(macrophage chemoattractant protein2, MCP2)，属于CC型趋化因子家族，研究发现，乳腺癌、肺癌等肿瘤均表达MCP2蛋白，MCP2表达与肿瘤进展密切相关[7-9]。

本研究中先用抗体芯片技术，检测M2 TAMs与ESCC共培养后差异表达的细胞因子及趋化因子，将筛选出的趋化因子MCP2加入ESCC培养基中，观察MCP2刺激后对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响，探讨MCP2在ESCC迁移和侵袭中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料食管鳞状细胞癌Eca109细胞购自武汉大学细胞库，KYSE-150细胞由中国医学科学院赠送。抗体芯片(AAH-CYT-G5, 北京博奥晶典生物技术有限公司)，MCP2(北京神州义翘科技有限公司)，蛋白质抽提试剂盒购自碧云天生物技术公司，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO(Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1 细胞培养和细胞培养上清的制备 食管癌Eca109细胞和KYSE-150细胞在37℃，5%CO2条件下培养于含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100 IU/mL)及链霉素 (100 IU/mL) 的RPMI1640培养液中。建立食管癌细胞与M2 TAMs共培养体系，并将培养基换成无血清培养基，共培养48 h后收集培养液上清，采用蛋白质抽提试剂盒制备细胞蛋白。以食管癌细胞加M2型TAMs为共培养组，以正常培养食管癌细胞为非共培养组。

1.2.2 抗体芯片筛查 采用AAH-CYT-G5抗体芯片及其检测试剂盒，按试剂盒说明进行操作。抗体芯片放置孵育盒中，加入2 mL封闭缓冲液，室温振荡孵育1 h; 每张芯片加入2 mL含1.2 mg蛋白质的细胞培养上清和细胞裂解液，4℃振荡孵育过夜; 去除样品液，加入约2 mL的1×洗液Ⅰ于室温振荡清洗; 去除洗液Ⅰ，加入1×洗液Ⅱ于室温振荡清洗; 去除洗液II，加入1 mL生物素标记的混合抗体，于室温孵育2 h; 抽去洗液II，加入2 mL 5 000倍稀释的荧光剂CW800标记的链霉亲和素，室温避光振荡孵育2 h; 荧光扫描(Licor-Odyssey)获取图像(每组设3个重复，每组实验重复3次)。

1.2.3 MCP2处理细胞 将食管癌Eca109细胞和KYSE150细胞接种于6孔板，细胞培养基更换为无血清培养基，培养基中加入MCP2(50 ng/mL)培养48 h，作为MCP2处理组。加PBS代替MCP2作为未处理组(每组设3个重复，每组实验重复3次)。

1.2.4 细胞划痕实验 细胞接种于6孔板，恒温细胞培养箱中培养，用10 μL无菌枪头在6孔板底部轻划一条力度和角度一致、粗细均匀的直线(每组设3个重复，每组实验重复3次)。分别于0、24、48 h在倒置相差显微镜下观察同一视野划痕的宽度并拍照。

1.2.5 细胞侵袭实验 配制基质胶，将配制的基质胶加入到Transwell小室的上室面，置于细胞培养箱中过夜使其充分干燥。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的1640培养基作为趋化剂，细胞用无血清培养基混匀后加入上室面(5×104/孔)，置于恒温细胞培养箱培养48 h后 ，用棉签轻轻擦去上室面未穿过膜的细胞，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，结晶紫染色30 min后再用PBS清洗，显微镜下观察，每个样本随机选取4个视野，计数每个视野染色细胞的数量，即穿膜细胞数，取平均值(每组设3个重复，每组实验重复3次)。

2 结果

2.1抗体芯片筛查细胞因子用抗体芯片筛查共培养组与非共培养组细胞培养上清中差异表达的细胞因子(图1a)。结果显示，共培养组培养上清中MCP2表达增加，与非共培养组相比，差异有统计学意义(P<0.05, 图1b、1c)。

a： 抗体芯片筛查培养上清中差异表达的细胞因子 b、c： Eca109细胞和KYSE-150细胞与M2TAMs共培养后MCP2的表达明显增加

(注：与非共培养组比较，*P<0.05，**P<0.01)

图1抗体芯片筛查细胞因子

2.2MCP2对细胞迁移能力的影响MCP2作用48 h后细胞划痕愈合能力明显增强，差异有统计学意义(P<0.05, 图2a、b)。

从理论上来讲，西方国家由工业社会步入到后工业社会的时代背景以及工业社会产生的诸多生态弊病催生了可持续发展理论和绿色发展理念，其成为发展绿色矿业的理论来源。

2.3MCP2对细胞侵袭能力的影响与对照组比较，MCP2处理组的穿膜细胞数明显增加(图2c)，经比较差异有统计学意义(P<0.001) (图2d)，表明MCP2处理能增强ESCC细胞的侵袭能力。

3 讨论

肿瘤微环境是调节肿瘤生物学行为的重要成分之一，微环境中的细胞因子、趋化因子等通过与肿瘤细胞的相互作用，促进肿瘤的生长和转移[10-11]。转移是恶性肿瘤的生物学特征之一，转移使肿瘤细胞离开原发组织器官，通过循环系统转移到继发组织器官，并形成新的病灶，肿瘤转移也是导致患者预后不佳的主要因素[12-13]。

肿瘤微环境是肿瘤细胞存活和进展的基础，MCP2是微环境中重要的趋化因子，研究发现MCP2与多种肿瘤的进展有关，而MCP2在食管癌迁移、侵袭中的作用尚不明确[14-16]。本研究将食管癌细胞与M2 TAMs共培养，筛查共培养后细胞培养上清中差异表达的细胞因子，以研究这些细胞因子对食管癌恶性表型的影响。结果发现，共培养组中Eca109细胞及KYSE-150细胞培养上清中MCP2的表达明显增加，与非共培养组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。另外，通过细胞功能学实验来验证MCP2对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞划痕实验表明，MCP2处理48 h后，Eca109细胞与KYSE-150细胞的迁移能力明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell小室细胞侵袭实验表明，MCP2处理48 h后，Eca109细胞和KYSE-150细胞的侵袭能力均明显增加，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究结果表明，MCP2可促进ESCC细胞的迁移和侵袭。

肿瘤的发生、发展是一个复杂的生物学过程，本研究通过细胞功能学实验，分别验证了MCP2在食管癌迁移、侵袭中的重要作用，但MCP2参与食管癌迁移和侵袭的机制尚不明确，此外，MCP2的促瘤作用还需体外动物实验进一步验证。

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