IL-1β引起食管鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化的实验研究

周 剑， 刘 涛， 郑树涛， 刘 清， 陈玉梅， 马 蓉， 谭豆豆， 卢晓梅

(新疆医科大学1附属肿瘤医院， 2临床医学研究院， 乌鲁木齐 830011)

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，致死率在我国恶性肿瘤中居第4位，我国食管癌约90%为食管鳞状细胞癌(ESCC)[1]。ESCC常发生侵袭转移，患者预后不佳，5 a生存率不足20%[2]。上皮-间质转化(EMT)是指肿瘤细胞由原来的上皮样形态逐渐转变为间质样形态，肿瘤细胞发生EMT可增强肿瘤细胞侵袭转移的能力，EMT在肿瘤进展过程中起着重要作用[3-5]。研究发现，IL-1β参与肿瘤细胞EMT过程，促进肿瘤发生侵袭转移。本研究用IL-1β处理ESCC细胞，观察细胞形态变化及EMT相关标志物的表达情况。

1 材料与方法

1.1材料食管鳞状细胞癌Eca109细胞购自武汉大学细胞库，KYSE-150细胞由中国医学科学院赠送。IL-1β (北京神州义翘科技有限公司)。TRIzol试剂(Thermo Fisher)，逆转录试剂盒和SYBR II荧光试剂盒(Takara)，E-钙黏蛋白(E-cadherin, 1∶1 000)、波形蛋白(Vimentin, 1∶1 000)、Slug(1∶1 000)均购自CST公司。胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，DMSO(Invitrogen)。

1.2IL-1β处理细胞食管鳞状细胞癌Eca109细胞和KYSE-150细胞接种于6孔板，细胞培养基更换为无血清培养基，培养基中加入IL-1β(100 ng/mL)培养48 h，作为IL-1β处理组。加PBS作为阴性对照组(每组设3个重复，每组实验重复3次)。

1.3实时荧光定量聚合酶联反应(qRT-PCR) 收集Eca109细胞和KYSE-150细胞，PBS清洗后加入TRIzol试剂提取总RNA，用反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA，SYBRⅡ荧光试剂盒对反转录的cDNA做RT-PCR，按说明设置反应条件，GAPDH作为内参。结果用Log10(2-△△Ct)法进行相对定量比较(每组设3个重复，每组实验重复3次)，每组实验重复3次，反转录及qRT-PCR所用引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 所用引物列表

1.4Westernblot检测EMT相关标志物表达收集食管癌细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白上样量为50 μg/孔，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜，荧光二抗孵育2 h，LI-COR系统(Odyssey)扫膜并分析(每组实验重复3次)。

2 结果

2.1IL-1β处理后细胞形态学改变食管鳞状细胞癌细胞Eca109和KYSE-150经IL-1β(100 ng/mL)刺激48 h后，细胞形态由卵圆形变为梭形，细胞极性丧失，细胞间连接变松散(图1)。

2.2IL-1β处理后EMT相关标志物mRNA的表达用qRT-PCR检测EMT相关标志物mRNA表达。结果发现，IL-1β处理后Eca109和KYSE150 E-cadherin表达降低，而间质标志物Vimentin和Slug表达增强，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01, 图2)。

2.3Westernblot检测EMT相关标志物蛋白的表达Western blot结果显示，IL-1β处理后Eca109和KYSE-150 E-cadherin表达下调，而间质标志物Vimentin和Slug表达上调(图3)。

3 讨论

IL-1β是一种促炎细胞因子，在多种肿瘤中IL-1β表达明显增加[6]。有研究发现，IL-1β可通过招募中性粒细胞从而提高肿瘤患者的无复发生存率[7]。但多数研究表明，IL-1β与肿瘤的进展有关[8-9]。在乳腺癌的研究中发现，IL-1β可使肿瘤细胞发生EMT，从而促进乳腺癌的侵袭转移[10]。胰腺癌的研究中则发现，IL-1β与NF-κB信号通路的激活及化疗的抗性有关[11]。本研究在ESCC培养基中加入IL-1β刺激48 h后，观察到ESCC细胞由典型的上皮样形态转变为间质样形态，细胞由圆形、卵圆形，变成梭形，细胞间连接变疏松，表明IL-1β刺激后食管癌细胞有可能发生EMT。随后，通过qRT-PCR及Western blot检测EMT相关标志物mRNA和蛋白的表达水平，结果显示E-cadherin表达减少，而间质标志物Vimentin和Slug表达增加，这与EMT过程中细胞外基质降解、细胞骨架重排有关。此外，研究发现Slug信号表达上调与软骨肉瘤和卵巢癌的EMT过程有关[12-13]，本研究结果与文献报道一致，表明IL-1β可引起食管癌细胞发生EMT。

研究表明，肿瘤微环境中IL-1β可促进癌基因的表达，并释放抗凋亡信号，影响肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤细胞过度增殖，进而促进肿瘤发生浸润转移[14-16]。本研究结果表明，食管癌微环境中的炎性细胞因子IL-1β可引起食管癌细胞发生EMT，但IL-1β引起食管癌发生EMT的机制及IL-1β与食管癌侵袭转移的关系还有待于进一步研究。

肿瘤的侵袭转移是一个多因素参与的复杂的过程，EMT在肿瘤浸润转移过程中扮演着重要角色。本研究仅从mRNA和蛋白水平验证食管癌细胞发生EMT，但EMT与肿瘤发生侵袭转移的关系还有待于组织水平和动物模型实验的进一步验证。

参考文献：

[1] CHEN W, ZHENG R, ZUO T ,et al. National cancer incidence and mortality in China, 2012[J]. Chin J Cancer Res, 2016, 28(1):1-11.

[2] ZHANG L, MA J, HAN Y ,et al. Targeted therapy in esophageal cancer[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2016, 10(5):595-604.

[3] GONZALEZ D M, MEDICI D. Signaling mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition[J]. Sci Signal, 2014,7(344):8.

[4] LAMOUILLE S, XU J, DERYNCK R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(3):178-196.

[5] LI L, LI W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer:comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation[J]. Pharmacol Ther, 2015(150):33-46.

[6] YANG W, YU X H, WANG C, et al. Interleukin-1beta in intervertebral disk degeneration[J]. Clin Chim Acta, 2015(450):262-272.

[7] CHEN L C, WANG L J, TSANG N M, et al. Tumour inflammasome-derived IL-1beta recruits neutrophils and improves local recurrence-free survival in EBV-induced nasopharyngeal carcinoma[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4(12):1276-1293.

[8] ZIENOLDDINY S, RYBERG D, MAGGINI V, et al. Polymorphisms of the interleukin-1 beta gene are associated with increased risk of non-small cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2014, 109(3):353-356.

[9] LI Y, WANG L, PAPPAN L, et al. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation[J]. Mol Cancer, 2012(11):87.

[10] JEON M, HAN J, NAM S J, et al. Elevated IL-1beta expression induces invasiveness of triple negative breast cancer cells and is suppressed by zerumbone[J]. Chem Biol Interact, 2016(258):126-133.

[11] 王栋, 刘清, 郑树涛, 等. TGF-β1促进食管癌上皮间质转化的发生发展[J]. 新疆医科大学学报, 2015,38(12):1470-1475.

[12] LI G, YANG Y, XU S, et al. Slug signaling is up-regulated by CCL21/CCR7 to induce EMT in human chondrosarcoma[J]. Med Oncol, 2015, 32(2):478.

[13] YUAN H, KAJIYAMA H, ITO S, et al. HOXB13 and ALX4 induce SLUG expression for the promotion of EMT and cell invasion in ovarian cancer cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13359-13370.

[14] GARLANDA C, DINARELLO C A, MANTOVANI A. The interleukin-1 family:back to the future[J]. Immunity, 2013, 39(6):1003-1018.

[15] BALLAK D B, STIENSTRA R, TACK C J, et al. IL-1 family members in the pathogenesis and treatment of metabolic disease:Focus on adipose tissue inflammation and insulin resistance[J]. Cytokine, 2015, 75(2):280-290.

[16] AFONINA I S, MULLER C, MARTIN S J, et al. Proteolytic processing of interleukin-1 family cytokines:variations on a common theme[J]. Immunity, 2015, 42(6):991-1004.