参附注射液对多柔比星致心肌病大鼠心肌组织转化生长因子-β1和Smad3 蛋白表达的影响

张志刚 刁墨芝 常文华 陈 菲 孙国栋 刘 磊 侯晓青 姬海荣

(聊城市人民医院药学部，山东 聊城 252000)

心肌病主要特征为心室功能不全和心肌纤维化〔1，2〕，其发病原因复杂，其中转化生长因子(TGF)-β1/Smad3信号转导通路被证明与心肌病心肌纤维化发生机制关系密切〔3〕。附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii)的子根，因附于乌头而得名。性味甘，“入心、肝、肾三经”，常用于回阳救逆，补火助阳，逐寒去湿。参附注射液由红参、附片中提取的有效成分精制而成，主要含人参皂甙、水溶性生物碱等，具有广泛药理作用，能清除氧自由基、扩张冠状动脉、改善心功能、降低血液黏度、改善血流变学等〔4〕。课题组前期已证明参附注射液可以通过抑制多柔比星引起的心肌细胞凋亡从而保护心肌〔5〕，本文观察多柔比星所致心肌病大鼠心肌纤维化的改变及心肌组织TGF-β1及Smad3蛋白表达的变化，研究参附注射液对心肌病大鼠心肌纤维化的保护机制。

1 材料与方法

1.1动物、药品、试剂及仪器 SD大鼠90只，清洁级，雌雄各半，体质量(150±15)g，由聊城市药品检验所提供〔许可证号：SYXK(鲁)2013 0009〕。参附注射液(四川雅安三九药业有限公司，批号：Z2009-3117，规格：10 ml/支，注射用盐酸多柔比星(浙江海正药业股份有限公司，批号：130702，规格：10 mg/瓶)。酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、兔抗TGF-β1、Smad3多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自北京中杉生物技术有限公司。生物机能实验系统(上海康为医疗科技发展有限公司)，高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，垂直电泳仪(美国BioRad公司)。

1.2模型建立及动物分组 大鼠随机均分为正常对照组，模型组，阳性对照组(卡托普利组)、高、低剂量参附组。模型组按照文献方法〔6〕腹腔注射多柔比星4 mg/kg，每周1次，共6 w，累计剂量达24 mg/kg；正常对照组腹腔注射等剂量0.9%氯化钠溶液；卡托普利100 mg·kg-1·d-1于实验开始前1 w灌胃。参附组于造模后1 w，腹腔注射参附注射液1 ml/kg，4 ml/kg，1次/d，共2 w。试验结束后，模型组有2只大鼠死亡，低剂量参附组1只死亡，其余大鼠纳入试验结果中。

1.3心功能测定 参附注射液末次给药后24 h后，腹腔麻醉大鼠，经右颈总动脉插管至左心室，生物机能实验系统检测心功能，测定左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)及左心室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.4心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达检测 取心肌组织匀浆，按照ELISA 试剂盒说明书检测。

1.5心肌细胞形态学观察 10%甲醛固定部分心室，乙醇脱水后石蜡包埋，5 μg切片，苏木素-伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察。

1.6Western印迹法检测心肌细胞TGF-β1、Smad3 蛋白表达 取待测心肌，裂解提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白质含量。上样电泳转膜，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(TBS)冲洗，封闭，加入TGF-β1、Smad3多克隆抗体(1∶1 000稀释)4℃过夜孵育，Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，加入羊抗兔二抗(1∶500稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次。显色液中避光显色。蛋白质印迹显影图扫描，凝胶自动分析成像软件进行灰度值(A)分析。用目标蛋白表达量的灰度值与内参蛋白(β-actin)的灰度值比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.7数据统计 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及LSD法t检验。

2 结 果

2.1各组心功能测定 与正常对照组相比，模型组 LVESP和±dP/dtmax 均明显下降，LVEDP显著上升(P<0.01)；与模型组相比，卡托普利组、高、低剂量参附组LVESP和±dP/dtmax 显著升高(P<0.01)，LVEDP显著下降(P<0.05)。卡托普利组和高剂量参附组差异无统计学意义(P>0.05)，和低剂量参附组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2心肌形态学变化 正常对照组肌纤维完整，心肌细胞形态规则，间质未见血管扩张。模型组心肌纤维肿胀、断裂，炎性细胞浸润。卡托普利组肌纤维轻度肿胀，血管扩张和炎性细胞浸润程度减轻。高剂量参附组肌纤维肿胀减轻，炎性细胞偶有浸润。见图1。

2.3心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达 与正常对照组比较，模型组心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显增强 (P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组和高剂量参附组心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显减弱(P<0.01)。卡托普利组和高剂量参附组差异无统计学意义(P>0.05)，和低剂量参附组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4各组心肌细胞TGF-β1、Smad3蛋白表达 与正常对照组比较，模型组心肌细胞的TGF-β1、Smad3蛋白表达明显增强 (P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组和高剂量参附组心肌细胞的TGF-β1、Smad3蛋白表达明显减弱(P<0.01)。卡托普利组和高剂量参附组差异无统计学意义(P>0.05)，和低剂量参附组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2。

图1 各组心肌组织 HE 染色变化(×200)

组别LVESPLVEDP+dp/dtmax-dp/dtmaxⅠ型胶原(mg/L)Ⅲ型胶原(mg/L)TGF⁃β1/β⁃actinSmad3/β⁃actin正常对照组135±13255±123956±563764±751755±1571254±134024±001018±000模型组76±1021)107±221)2854±261)3064±431)3028±1251)2564±0881)078±0431)064±0121)卡托普利组118±932)63±042)3618±252)3496±182)1524±1082)1314±1352)032±0202)030±0042)低剂量参附组95±833)82±183)3134±523)2824±293)2426±1143)2132±1023)052±0323)051±0233)高剂量参附组128±962)4)59±102)4)3789±322)4)3602±282)4)1698±2012)4)1201±0422)4)029±0052)4)023±0102)4)

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与低剂量参附组比较：4)<0.05

1.正常对照组；2.模型组；3.卡托普利组；4.低剂量参附组；5.高剂量参附组图2 各组心肌细胞TGF-β1、Smad3蛋白表达

3 讨 论

多柔比星是临床常见的抗肿瘤药物，但其剂量相关的心肌毒性可引起心肌细胞钙超载和跨膜电位紊乱〔7〕，还可以导致心肌纤维化产生类似于扩张型心肌病的病理改变〔8〕。心肌胶原纤维主要由Ⅰ、Ⅲ 型胶原蛋白组成，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达反映出心肌纤维化的严重程度〔9〕。TGF-β1是具有多重生物学效应的生长因子，与心肌纤维化发生密切相关〔10，11〕。Smad3蛋白是TGF-β1下游蛋白，把TGF-β1信号从细胞外传递到细胞核，TGF-β1蛋白表达上调常伴随着Smad3的表达上调〔12〕。TGF-β1/Smad3信号通路可抑制细胞外胶原蛋白分解酶的释放，抑制胶原蛋白分解，促进纤维化形成〔13〕。

参附注射液中的人参皂苷等成分可改善心肌传导，维持心肌细胞膜完整性，其Ca2+拮抗作用可改善心脏的收缩和舒张功能〔14〕。本文说明参附注射液能减轻多柔比星致大鼠心功能损害。参附注射液可减轻多柔比星心肌纤维化的损害。本文结果表明TGF-β1/Smad3 蛋白表达增加可能促进了心肌纤维化的发展。参附注射液可不同程度抑制心肌病大鼠心肌组织TGF-β1和Smad3蛋白的表达。

综上，多柔比对心肌的损害可表现为心肌纤维化，心功能下降。Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增多，TGF-β1/Smad3 蛋白表达增加。而参附注射液可使心肌病大鼠心功能改善，胶原蛋白表达减少，TGF-β1/Smad3 表达减少。其可能通过调节TGF-β1/Smad3蛋白表达来抑制心肌纤维化的发展。

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