TGIF2对高糖诱导的血管内皮细胞生物学行为的影响

何淑珍 黄 磊 阮 丹

(武汉市武昌医院(三级医院)老年病科，湖北 武汉 430063)

血管并发症是引起糖尿病患者致残和致死的重要因素，而导致血管损伤的原因与血管内皮细胞的生物学功能障碍关系密切。因此，改善血管损伤是治疗糖尿病血管并发症的重要手段。同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(TGIF)家族是属于三氨基酸环延伸(TALE)超级家族成员，在肿瘤、代谢和组织分化等多种方面发挥重要的调控作用〔1～3〕。TGIF2是TGIF家族中的重要成员，有研究发现，TGIF2在糖尿病胰岛β细胞的分化和形成中发挥促进作用〔4〕。然而，在高糖诱导的血管损伤中，目前并未发现TGIF2是否参与调控。本研究通过观察TGIF2在高糖诱导下血管内皮细胞中的表达，以脂质体转染上调其表达，观察其对血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR质粒和空载体阴性对照质粒(NC)购于上海派森诺公司。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购于美国ATCG公司，DMEM培养基购于GIBCO公司，荧光标记的羊抗兔IgG抗体、β-actin抗体和TGIF2抗体购于北京中杉金桥公司，胎牛血清、Lipofectmine2000和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂购于美国Sigma公司。RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购于大连宝公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和细胞裂解液购于上海碧云天公司，流式细胞仪和酶标仪分别购于美国BD公司和普利莱公司。PCR仪和电泳仪购于美国Bio-Rad公司，倒置显微镜购于日本Olympus公司，Transwell小室购于美国Corning公司，紫外分光光度仪购于上海第H仪器厂。

1.2细胞培养、分组和转染 在温度为37℃、CO2体积分数为5%环境下，以含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待HUVECs细胞融合度达到80%左右时，胰酶消化，传代。取24孔细胞板，以每孔30 000个细胞接种。收集生长状态良好的HUVECs细胞进行实验。将细胞随机分为4组，对照组：不做处理；高糖组：25 mmol/L D-葡萄糖干预；NC高糖组：先转染NC，再加入25 mmol/L D-葡萄糖进行干预；TGIF2高糖组：先转染psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR质粒，再加入25 mmol/L D-葡萄糖进行干预。参照Lipofectmine2000使用说明将2.5 μl终浓度均为30 nm的psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR质粒/NC、10 μl Lipofectmine2000和200 μl无血清培养基转染至siRNA TGIF2高糖组/NC高糖组细胞中，转染24 h后，加入D-葡萄糖处理48 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.3RT-PCR检测 采用Trizol法提取各组HUVECs细胞的总RNA，并采用紫外分光光度计定量其浓度。经逆转录试剂盒合成cDNA。将配制好的20 μl反应体系上PCR仪扩增。其中，每组设3个平行孔。β-actin上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游：5′-GCTGTCACCTTCACCCTTCC-3′；TGIF2上游引物：5′-GGCACCTAGCAGAGAAA-GATAAG-3′，下游：5′-GGGAGGCTGAGGCAAATAAT-3′。反应条件：94℃预变性240 s，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸120 s，上述过程重复35次。以内参β-actin校正，2-△△Ct法计算TGIF2 mRNA相对表达水平。

1.4Western印迹检测 向4组细胞中加入细胞裂解液，提取各组细胞的总蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒对其定量。将所提取的总蛋白以沸水浴变性5 min后，取60 μg上样至10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分离，每组设置3个复孔。开始以80 V电泳，至分离胶后改为120 V。待结束后，以半干法转印。再将转印后的PVDF膜置于含有5%脱脂奶粉的封闭液中。反应2.5 h后，加入1 000倍稀释的TGIF2抗体和β-actin抗体，4℃下过夜。次日，经Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤后，加入2 500倍稀释的二抗，反应1 h。洗膜后，加显色液电化学发光(ECL)显影。以β-actin作内参，Image J软件分析各组HUVECs细胞中TGIF2蛋白的相对表达量。

1.5细胞增殖实验 取96孔细胞板，以每孔55 000个细胞接种，以10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养。实验分组及处理同1.2，每组设5个平行孔，每组重复3次。处理完毕后，在孵箱中培养24 h和48 h后，取出培养板。每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml MTT溶液，培养4 h后弃上清，加150 μl二甲基亚砜。待充分反应后，以酶标仪检测各组HUVECs细胞在570 nm处的吸光度(OD)值。

1.6细胞迁移实验 以无血清的DMEM培养基悬浮4组细胞，制备浓度为50 000个/ml的细胞悬液。取Transwell小室(孔径8 μm)，上室中加细胞悬液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清DMEM培养基500 μl。将小室置于孵箱(条件为5%CO2、37℃)中孵育24 h后取出。轻轻擦去上室中细胞，以4%甲醇固定10 min后，加吉姆萨染色5 min。经漂洗液清洗晾干后，置于200倍显微镜下观察。随机取5个视野，统计穿膜细胞数目，计算平均值。每组实验重复3次。

1.7细胞凋亡实验 取4组细胞，以预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞后，离心弃上清，加入200 μl结合缓冲液重悬细胞后，分别加入体积均为5 μl Annexin V/FITC和PI进行双染色。37℃下避光反应20 min后，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。每组实验重复3次。

1.8统计学分析 应用SPSS21.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1高糖诱导下调TGIF2表达及转染效果 与对照组相比，高糖组、NC高糖组和TGIF2高糖组HUVECs细胞中TGIF2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与高糖组相比，NC高糖组细胞差异均无统计学意义(P>0.05)，而TGIF2高糖组均显著升高(P<0.05)。见表1，图1。

图1 Western印迹检测结果

组别TGIF2mRNATGIF2蛋白对照组101±005054±003高糖组042±0031)020±0021)NC高糖组040±0021)018±0031)TGIF2高糖组073±0061)2)041±0051)2)F/P值135676/000076489/0000

与对照组比较：1)P<0.05；与高糖组比较：2)P<0.05，下表同

2.2上调TGIF2表达减弱高糖对HUVECs细胞增殖的抑制作用 在相同作用时间下，与对照组相比，高糖组、NC组和TGIF2高糖组中HUVECs细胞活力均明显降低(P<0.05)；而高糖组和NC高糖组间细胞活力无显著变化(P>0.05)，但TGIF2高糖组细胞活力显著高于高糖组(P<0.05)。见表2。

表2 各组HUVECs细胞在570 nm处的OD值

2.3上调TGIF2表达减弱高糖对HUVECs细胞迁移的抑制作用 与对照组穿膜细胞数〔(81.0±7.8)个〕比较，高糖组、NC高糖组、TGIF2高糖组〔(52.5±5.0)、(49.2±6.5)、(65.5±4.2)个〕HUVECs细胞的迁移能力均明显降低(P<0.05)；而NC高糖组较高糖组无显著变化(P>0.05)，但TGIF2高糖组较高糖组显著增强(P<0.05)。

2.4上调TGIF2表达抑制高糖诱导的HUVECs细胞凋亡 高糖处理后HUVECs细胞的凋亡率显著高于对照组(5.28%±0.35%，P<0.05)；与高糖组(16.45%±2.02%)比较，NC高糖组(15.76%±1.63%)差异无统计学意义(P>0.05)，但TGIF2高糖组(10.06%±1.25%)显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

有研究显示，糖尿病患者发生心脑血管疾病的概率明显高于非糖尿病患者〔5〕。糖尿病血管并发症是糖尿病患者中最为严重的并发症之一，高糖是其重要诱因。血管内皮细胞功能受损是糖尿病血管病变的重要机制〔6〕。血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡与糖尿病血管病的发生发展关系密切，寻找有效的治疗靶点进行早期干预对治疗和缓解糖尿病血管并发症具有重要意义。

TGIF2可结合DNA或与Smads相互作用抑制TGFp基因表达发挥抑制作用，参与如癌症、骨质疏松等生理病理过程〔7～9〕。Hu等〔10～12〕研究表明，TGIF2是miR-34a基因的靶基因，miR-34a能够通过下调TGIF2表达，调控胃癌细胞侵袭和转移、减轻激素诱导的股骨头缺血性坏死和抑制多发性骨髓瘤肿瘤干细胞的生长。Shen等〔13〕指出，miR-34a在糖尿病患者外周血中高表达；同时，Li等〔14〕发现，氧化应激蛋白p66Shc能够通过诱导miR-34a产生，导致糖尿病血管内皮功能障碍；另外，TGIF2在糖尿病胰岛β细胞的分化和形成中发挥重要的促进作用〔4〕。因此推测TGIF2也可能在糖尿病血管内皮损伤方面发挥重要作用。杨亚丽等〔15〕研究发现，TGIF2在胶质瘤组织中高表达，沉默其表达能显著抑制A172细胞增殖、迁移能力，并促进凋亡。目前，糖尿病血管内皮损伤的发生和发展机制尚不明确，本研究结果提示，TGIF2可能在糖尿病血管内皮损伤过程中发挥着抑制HUVECs细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡的作用。

综上，在高糖作用下，HUVECs细胞中TGIF2低表达，在血管内皮损伤中发挥重要作用；上调TGIF2表达后，对高糖引起的血管内皮损伤有一定的改善作用。

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