中风回语颗粒对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响及机制

2018-05-11俞之胤李晓华石晓征修凡懿

中国老年学杂志 2018年8期

俞之胤韩冬李娜李晓华石晓征阚默修凡懿王健

(长春中医药大学，吉林长春 130117)

脑血管疾病为临床常见病，以缺血性脑血管病最为普遍，在治疗过程中首先应该恢复缺血区的血流供应，但是，同时又会造成脑缺血再灌注损伤〔1,2〕。中风回语颗粒是临床经验方，作为院内制剂应用多年，由石昌蒲、郁金、黄连、冰片、川芍等10味中药组成，具有化痰宣窍，清热化癖，透脑清神等功效，用于缺血性脑卒中的治疗〔3〕。本研究观察中风回语颗粒对缺血再灌注引起脑组织损伤的影响及机制。

1 材料与方法

1.1动物成年昆明种小鼠，雄性，体重22～26 g，清洁级，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-(吉)2011-0003。小鼠在SPF级实验室条件下饲养，所有小鼠自由摄食及饮水。

1.2药品与试剂盐酸美金刚片(丹麦灵北药厂)；中风回语颗粒颗粒(长春中医药大学研发中心)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测试盒、一氧化氮(NO)测试盒、一氧化氮合酶(NOS)、T-ATPase试剂盒、Na+-K+-ATPase试剂盒、Ca2+-Mg2+-ATPase试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3动物分组及小鼠脑缺血再灌注损伤模型建立 120只小鼠随机分为：假手术组(n=20)、模型组(n=20)、中风回语颗粒低剂量组(n=20)、中风回语颗粒中剂量组(n=20)、中风回语颗粒高剂量组(n=20)及盐酸美金刚组(n=20)。中风回语颗粒低、中、高剂量组分别按剂量体重比1.2 g/kg，2.4 g/kg，4.8 g/kg灌胃中风回语颗粒溶液，盐酸美金刚组按剂量体重比3 mg/kg灌胃盐酸美金刚片溶液。用羧甲基纤维素钠溶液稀释所有小鼠灌胃药物，假手术组及模型组按体重给予等体积羧甲基纤维素钠溶液，各组小鼠连续灌胃给药7 d。末次给药后30 min，所有小鼠用水合氯醛(3.5%)腹腔注射麻醉，按文献方法〔4,5〕制备小鼠脑缺血再灌注模型，从胸骨柄到下领骨切口，分离左侧颈总动脉，颈外动脉及颈内动脉。用动脉夹暂时夹闭颈内、颈总动脉，在颈外动脉上切口，将栓线插入，并打一个松结，然后松开动脉夹，继续插入栓线，当栓线遇到轻微阻力，停止插入，表明成功阻断大脑中动脉，计时，1 h后，拔出线栓，进行再灌注，计时，24 h后，完成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组小鼠只进行手术，不实施缺血再灌注操作。

1.4实验方法与观察指标 (1)神经行为学评分：各组随机选取10只小鼠，观察存活小鼠行为变化，参考Wayne Clark评分(0～28分)〔6〕，主要观察小鼠的身体对称性(0～4分)；步态(0～4分)；攀爬(45°粗糙平面，0～4分)；转圈实验 (在实验台表面，0～4分)；前肢对称性(小鼠从尾部悬起，0～4分)；强迫转圈(前肢着于平面，提尾使后肢悬空，0～4分)；胡须反应性(从后部轻触)。(2)各组剩余的10只小鼠颈椎脱臼处死，取脑缺血侧脑组织，通过生理盐水制成10%的脑组织匀浆，离心(4 000 r/min，10 min)后取上清，依次按GSH-PX试剂盒、SOD试剂盒、NOS试剂盒、T-ATPase试剂盒、Na+-K+-ATPase试剂盒、Ca2+-Mg2+-ATPase试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒方法，测定GSH-PX，SOD，NOS，T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性和MDA、NO含量〔7,8〕。

1.5统计学分析采用SPSS13.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结果

2.1各组神经功能评分比较假手术组(0.00±0.00)分未见明显神经功能损害。与假手术组比较，模型组(24.18±3.66)分神经功能评分显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，盐酸美金刚组及中风回语颗粒中、高剂量组小鼠神经功能评分〔(14.56±2.08)分、(19.65±2.96)分、(18.92±2.65)分〕显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。低剂量组神经功能评分(21.21±4.38)分与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组脑组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较与假手术组比较，模型组脑组织MDA含量明显增加，而SOD、GSH-Px活性明显降低，差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，盐酸美金刚组及中风回语颗粒中、高剂量组MDA含量明显降低，而SOD、GSH-Px活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.3各组NO含量及NOS活性比较与假手术组比较，模型组NO含量及NOS活性均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，盐酸美金刚组及中风回语颗粒中、高剂量组NO含量及NOS活性均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.4各组T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性比较与假手术组比较，模型组T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均明显降低(均P<0.05)。与模型组比较，盐酸美金刚组及中风回语颗粒中、高剂量组T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表1 各组MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活性比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2 各组T-ATPase、Na+-K+-ATPase 、Ca2+-Mg2+-ATPase活性比较

3 讨论

本研究结果表明中风回语颗粒能够改善脑缺血再灌注损伤小鼠运动功能〔9〕。脑缺血时，脑组织内产生大量的自由基，但机体内抗氧化系统并不能同时提供，特别是在再灌注发生的时候，脑组织损伤进一步加重。MDA是不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产生的代谢产物，能够反映脂质过氧化程度〔10～12〕。脑缺血发生时，自由基生成显著增加，体内抗氧化物质被过度消耗，此时，SOD，GSH-Px活性表现为显著下降。因此，机体清除氧自由基的能力通常用GSH-Px，SOD的活性来表示〔13～15〕。本研究结果提示中风回语颗粒能提高脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织中抗氧化活性。

NO即是一种新型信使，也是一种自由基。已有文献报道，NO参与了脑缺血再灌注性损伤的诸多环节〔16〕。NO具有双重作用，一方面能够扩张脑血管，改善脑部循环，另外一方面可以抑制线粒体呼吸及过氧化膜脂质等作用引起神经元的损伤。本研究结果提示中风回语颗粒能减轻脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织NO的损伤。

Na+-K+-ATPase的主要功能是平衡细胞内外Na+，K+浓度，而Ca2+-Mg2+-ATPase的主要功能是维持细胞内Ca2+稳态。细胞ATP酶活性的改变是脑缺血再灌注后是神经质膜损害的明显标志，也是引起缺血后神经元过度损伤的重要因素。当脑缺血再灌注损伤发生时，能量耗竭，ATP酶活性下降，Na+-K+-ATPase活力下降导致细胞内Na+增高，胞内Na+增多引起Na+、Ca2+交换增加，进一步加剧细胞内Ca2+超载，引起迟发性细胞损伤〔17〕。本研究结果提示中风回语颗粒能够明显改善小鼠脑缺血时的耗竭状态，避免进一步加重再灌注引起的细胞内Ca2+超载，有利于缓解脑水肿，减轻神经元损伤，发挥其对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织的保护作用。

1颜娟，郑茂东.灯盏花素神经保护作用及其机制研究进展〔J〕.神经药理学报，2014；4(3):31-8.

2尚远宏，徐晓玉.中药及其提取物对脑缺血保护作用的实验研究进展〔J〕.中国中药杂志，2013；38(8):1109-15.

3林贺，曲晓波，律广富，等.中风回语颗粒对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及其抗氧化机制〔J〕.中药药理与临床，2014；30(4):102-4.

4Wang D，Yuan X，Liu T，etal.Neuroprotective activity of lavender oil on transient focal cerebral ischemia in mice〔J〕.Molecules，2012；17(8): 9803-17.

5颜娟.大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制研究〔D〕.石家庄：河北医科大学，2014.

6Clark WM，Lessov NS，Dixon MP，etal.Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse〔J〕.Neurol Res，1997；19(6): 641-8.

7田徽.艾片与合成冰片脑保护及其对血脑屏障影响机制的研究〔D〕.成都：成都中医药大学，2013.

8韩冬，张余威，刘苗，等.黄芪总皂苷对心室重构大鼠血流动力学及抗氧化作用的影响〔J〕.中国实验诊断学，2013；17(11):1956-9.

9张冲.低频弱磁诱导移植神经干细胞上调β-Ⅲtubulin mRNA表达修复脑损伤大鼠爬行功能的研究〔D〕.广州：南方医科大学，2017.

10丁彩娟，江勤，王鑫，等.补阳还五汤有效部位对动物全脑缺血损伤的保护作用及抗氧化与凋亡机制〔J〕.中药药理与临床，2017；33(4):2-7.

11葛建彬，卢红建，宋新建，等.枸杞多糖对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其抗氧化应激的机制研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2016；33(9):790-4.

12唐映红，黄小平，谭华，等.三七总皂苷对脑缺血再灌注后细胞外基质破坏及氧化应激的影响〔J〕.中华中医药学刊，2010；28(11):2327-30.