3种浓度乙醇提取的樟芝多糖对免疫缺陷小鼠模型免疫功能的调节作用研究

孔云 官俏兵 郭丽 李文燕 杨毅

有研究发现，雪灵芝多糖被证明有免疫增强作用[1-2]。樟芝作为台湾地区独有的一种天然多孔真菌，含有丰富的多糖、三萜、腺苷、氨基酸、蛋白质类物质[3]，其中多糖和三萜含量远远高于灵芝，有着很好的研究价值和应用前景[4-5]。但樟芝多糖在大陆分布较少，对于其多糖的作用尚未明确，因此笔者以多糖的免疫增强作用为切入点，进一步研究其药理作用，为樟芝多糖的开发研究提供借鉴，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级小鼠60只，体重（21±5）g，购置于浙江中医药大学动物实验中心[实验动物许可证号：SCXK（浙）2013-0184]，小鼠分笼饲养，每笼 6只，共 10笼。动物实验室温度为 20～25℃，湿度为（70±5）%，依据国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，小鼠活动、摄食自由。

1.2 试剂和仪器 固体樟芝总多糖（杭州众芝康公司，纯度85%），环磷酰胺（浙江海正药业），K562细胞（武汉普诺赛生物技术有限公司），刀豆蛋白A（ConA，美国Sigma公司），胎牛血清（FBS，美国 Gbico公司），二甲基亚砜（DMSO，美国 Sigma公司），RPMI1640完全培养基（美国Gibco公司），Elisa试剂盒（南京建成生物优先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP 单抗（美国 BioLegend公司），酶标仪（美国Thermo公司，型号为Multuskan Go 1510），显微镜（Olympusix71，德国徕卡公司），流式细胞仪（FASCC，美国BD公司）。

1.3 水提醇沉法提取樟芝多糖 本实验采用已经过初步提取和纯化的樟芝总多糖，将30g 85%樟芝总多糖溶于100ml热水，采用Sevag方法脱蛋白5次，提取水层后浓缩至原体积的10%，使用无水乙醇将樟芝多糖水溶液调节乙醇浓度为90%，4℃条件下静置12h，获得第一部分沉淀记为PW90，以此类推分别获得70%乙醇沉淀多糖记为PW70、50%乙醇沉淀获得的多糖记为PW50。采用硫酸-蒽酮法测定总多糖，BCA法测定总蛋白含量。

1.4 模型构建和分组 将清洁级小鼠60只随机分为对照组、模型组、总多糖组、PW90组、PW70组和PW50组，每组10只。除对照组外，其余5组小鼠按照50mg/kg的剂量，2d/次腹腔注射环磷酰胺-0.9%氯化钠溶液（将1g环磷酰胺溶解于1 000ml的0.9%氯化钠注射液，配制成1mg/ml的溶液）。而樟芝多糖的4组小鼠除注射环磷酰胺外，按100mg/（kg·d）的剂量腹腔注射含樟芝多糖的0.9%氯化钠注射液（将1g樟芝多糖溶解于500ml的0.9%氯化钠注射液，配制成2mg/ml的溶液）。其中总多糖组配制总多糖-0.9%氯化钠注射液（2mg/ml），而PW90组、PW70组和PW50组分别使用分级沉淀的多糖组分配制成2mg/ml的樟芝多糖-0.9%氯化钠注射液。对照组和模型组小鼠则每日注射等剂量的0.9%氯化钠注射液，按照上述方法干预14d后，断颈处死小鼠，无菌条件下分离脾脏、胸腺和外周血。

1.5 脾脏、胸腺指数的计算 脾脏指数=脾脏质量/小鼠的体重；胸腺指数=胸腺质量/小鼠体重。

1.6 脾脏提取淋巴细胞 无菌条件下得到的小鼠脾脏，剔除脂肪、结缔组织后用无菌手术剪剪成小块，然后研钵中研磨，加入3ml的0.9%氯化钠溶液后过滤，将过滤液1 500r/min离心5min，加入3倍体积的红细胞裂解液后重新混悬，离心后弃上清液得到沉淀细胞，用PBS重悬后调整细胞密度为2×106/ml。

1.7 淋巴细胞的增殖指数 将上述得到的淋巴细胞按照100μl/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔，加入0.5mg/ml的ConA培养液1μl，培养箱中培养6h，利用CCK-试剂盒检测450nm处吸光度（OD）。淋巴细胞增殖指数=实验组OD/对照组OD。

1.8 NK细胞的杀伤活性检测 将上述淋巴细胞200μl接种于96孔板，按照效-靶比为25∶1的比例加入等细胞数量的K562细胞8μl，设置效应细胞组、靶细胞组和对照组，每组设置5个复孔，培养48h后，以CCK-8法检测OD值，NK细胞的杀伤活性=[1-（效-靶细胞OD-效应细胞 OD）/靶细胞 OD]×100%。

1.9 T淋巴细胞亚群的检测 上述淋巴细胞吸取100μl加入流式细胞测试管，分别加入CD3、CD4、CD8抗体各1μl，混匀后避光 20min，PBS洗后离心 2次，用 PBS重悬后上机检测。

1.10 血清IL-2、IL-6、TNF-α 检测 小鼠断颈处死后，取小鼠外周血2ml，离心后取血清，按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.11 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较经Bonferoni校正后采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙醇沉淀多糖的纯度和蛋白含量结果 PW90、PW70、PW50的多糖含量分别为92.3%、89.8%和91.6%，蛋白含量分别为2.17、1.86、1.95mg/g。多糖含量均高于总多糖的85%，纯度较高。

2.2 各组小鼠胸腺、脾脏指数的比较 模型组小鼠胸腺、脾脏指数均低于对照组（均P＜0.05），3种樟芝多糖干预后可以不同程度提高胸腺、脾脏指数，且PW90组干预后胸腺、脾脏指数高于PW70组和PW50组（均P＜0.05）；3种多糖的胸腺指数和脾脏指数均高于总多糖（均P＜0.05），见表 1。

表1 各组小鼠胸腺、脾脏指数的比较（mg/g）

2.3 各组小鼠淋巴细胞增殖指数及NK细胞杀伤活性的比较 模型组小鼠的淋巴细胞增殖指数低于对照组（P＜0.05），而樟芝多糖干预后显著提高了淋巴细胞的增殖指数。PW90组干预后可以显著提高NK细胞的杀伤活性，与PW70组和PW50组、总多糖组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠淋巴细胞增殖指数和NK细胞杀伤活性的比较

2.4 各组小鼠淋巴细胞亚群的比较 模型组CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+的比例均显著低于对照组（均P＜0.05），而樟芝多糖可以显著提高3者的比例，且PW90组优于PW70组和PW50组、总多糖组（均P＜0.05），见表 3。

表3 各组小鼠淋巴细胞亚群的比较

2.5 各组小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比较 模型组小鼠的IL-2、IL-6和TNF-α的表达均显著低于对照组（均P＜0.05），而樟芝多糖可以显著提高小鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α的表达，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且PW90组优于PW70组和PW50组、总多糖组（P＜0.05），见表 4。

表4 各组小鼠IL-2、IL-6、TNF-α的比较

3 讨论

免疫系统是人抵御细菌、病毒感染的重要防线，而自身免疫功能的降低或者亢进都会引起一系列疾病的发生，比如类风湿性疾病、细菌感染、病毒感染等，临床中肿瘤的辅助性化疗亦会引起不同程度的免疫抑制，所以免疫增强药物的问世和应用就显得十分的必要[6-7]，环磷酰胺是一种常用细胞毒性药物，临床应用于各种恶性肿瘤的化疗和类风湿关节炎的治疗，也常被用于免疫抑制模型的构建[8]。本研究发现，环磷酰胺可以全面抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫，这一模型可以广泛的应用于免疫抑制或缺陷疾病病理和药物的研究。

多糖作为一个大家族的天然药物，有着多样的生理活性和作用，目前黄芪多糖、灵芝多糖和香菇多糖已经被开发成药物应用于免疫性疾病的辅助治疗，且获得了良好的效果，而樟芝作为大陆不常见的多孔真菌，与灵芝、云芝等有着很大的相似性，且天然的樟芝多糖含量远远高于灵芝，有着巨大的开发价值。以往有文献报道樟芝胞内和胞外多糖对于免疫抑制小鼠有着一定的免疫调节功能[9]，但是对于其确切的有效多糖成分未见说明，且多糖未经过除蛋白等纯化工艺，不能明确其有效的药理成分。鉴于此，本研究利用水提醇沉法对樟芝子实体的多糖进行提取纯化获得了3种多糖，分别为90%、70%、50%乙醇沉淀所得，通过多糖、蛋白含量检测，得到的3种多糖纯度较高，且糖蛋白含量较低。以免疫小鼠模型作为干预对象，结果显示3种多糖对于环磷酰胺构建免疫缺陷性的小鼠均有一定免疫增强作用。首先3种多糖均可以提高免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指数，胸腺是产生T淋巴细胞的主要器官，还可以分泌胸腺素，所以可以直接反映小鼠机体细胞免疫的强弱，而脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，2种指数结合可以一定程度上反映免疫功能的强弱[10]，通过对比发现，PW90多糖对于2种指数提高效果较为明显。在淋巴细胞增殖实验中，3种多糖均可以促进淋巴细胞的增殖，也可以增强NK细胞的杀伤能力，这证明了樟芝多糖可以改善NK细胞的杀伤作用，对机体的细胞免疫有着很好的增强作用，淋巴细胞亚群的变化也很好地印证了上述细胞免疫增强的结果[11]。在体液免疫方面可以提高血清中IL-2、IL-6和TNF-α的表达，IL-2是T细胞生长因子，活化Th1细胞，促进CTL的增殖，对机体的抗体反应有着重要的作用，IL-6促进T细胞和成纤维细胞产生淋巴因子，增强NK细胞的功能[12]。樟芝多糖对于3者的促表达作用，提高了机体体液免疫功能，所以樟芝多糖对于免疫抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫都有很好的调节作用，且PW90效果优于其他2种多糖和总多糖。

综上所述，本研究分离获得了3种樟芝多糖均可以提高免疫抑制小鼠的免疫功能，且对于细胞免疫和体液免疫均有增强作用，其中90%乙醇沉淀获得的多糖效果最佳，但是其确切的组成成分还有待进一步研究。

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