miR-455-5p在结直肠癌中的表达及生物学特性

王金秋 鲁杨 柯孔亮 张乐鸣

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的恶性肿瘤，占全球癌症死亡原因的第3位[1]。而我国CRC发病率及死亡率均位居世界首位[2]。CRC的发展是一个多步骤、多因素的过程，而其中的机制至今尚未完全清楚[3]。微小RNA（miRNA）是一类长度为22～25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中[4]。已有研究发现miRNA通过调控肿瘤发生、发展过程中多个关键的步骤及基因，在细胞生长、分化及凋亡等多种生物过程中发挥作用，是肿瘤的潜在治疗靶点和预后预测指标[5-7]。miR-455-5p位于第6条染色体上，多项研究发现它在甲状腺髓样癌[8]、黑色素瘤[9]、胃癌[10]等呈低表达。目前关于miR-455-5p在CRC的作用研究较少，故笔者拟探讨miR-455-5p在CRC中的表达及生物学特性，以初步明确其靶基因，探讨可能存在的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集宁波市第一医院2016年3至7月收治的40例CRC患者经手术切除的癌组织标本及癌旁10cm的正常黏膜组织标本，其中直肠标本21份，结肠标本19份；组织标本离体后立即放入RNA保存液中，后转入-80℃冰箱中保存。40例CRC患者中，男24例，女 16 例；年龄 43～85（65±11）岁，≥60 岁 28 例，＜60岁12例；TNM临床分期为Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例；肿瘤分化程度为中分化28例，中-低分化5例，低分化7例。所有患者术前未行放化疗或免疫治疗，无其他肿瘤疾病史。本研究经宁波市第一医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.1.2 细胞株 人结肠癌 SW-480、HCT-116、HT-29细胞株，购自上海诺百公司。

1.1.3 试剂及仪器Trizol Reagent（15596-026，invitrogen公司）；氯仿（AR级，上海国药）；异丙醇（AR 级，上海国药）；75%无水乙醇（AR级，上海国药）；焦碳酸二乙酯水（750024，invitrogen公司）；RNase抑制剂（E00381，上海拜力生物公司）；特异性引物（Oligo，invitrogen公司）；100mM dNTPs（18427013，invitrogen 公司）；Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒（KGA1018，凯基生物公司）；0.05%胰蛋白酶（25200-072，IVGN公司）；蛋白标志物（DM111-01，北京全式金生物公司）；DMEM（SH30023.01B，上海鲁汶生物公司），FBS（S1810-500，Biowest南美血源公司）；Brdu细胞增殖检测试剂盒（ED1100，Boster公司），Brdu细胞增殖抗体（BM0201，Boster公司），Brdu抗体对应荧光二抗[aatbio，iFluorTM488 goat anti-mouse IgG（H+L），赛默飞公司]；RIPA 蛋白裂解液（杭州昊鑫生物公司），CO2培养箱（HFI51，力康），荧光显微镜（IX51，奥林巴斯），显微镜（CKX31，奥林巴斯）；生物安全柜（HFsafe 1200 A2，力康），流式细胞仪（BD FACSCALIBUR，碧迪医疗）。

1.2 方法

1.2.1 组织标本RNA提取 将组织标本进行研磨、贴壁等预处理后，置于无RNA酶溶液的1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，剧烈摇晃、吹打，按照试剂盒说明书的步骤提取总RNA。

1.2.2 qRT-PCR法检测miR-455-5p表达水平 按照说明书进行操作。逆转录体系为20μl。按下列反应条件进行逆转录：25℃ 5min，50℃ 60min，70℃ 15min。每个样本PCR反应总量共20μl，按以下条件在定量PCR仪上进行反应：95℃ 2 min，95℃ 10s，60℃ 60s，70℃ 45s，共40个循环。miR-455-5p的表达水平采用2-ΔΔCt法分析，并以相对表达定量值表示[ΔΔCt=待测样品（MeanCt目-MeanCt内）-对照样品（MeanCt目-MeanCt内）]。miR-455-5p、PIK3R1及U6的引物序列见表1。

表1 miR-455-5p、PIK3R1及U6的引物序列

1.2.3 CRC细胞转染 选择细胞状态良好的SW480、HCT-116、HT-29细胞进行培养，使细胞生长至密度为70%～80%。采用脂质体转染试剂转染3株细胞，其中miR-455-5p-mimics为miR-455-5p模拟剂，mimics-NC为 miR-455-5p-mimics对照组；miR-455-5p-inhibitor为 miR-455-5p抑制剂，inhibitor-NC为miR-455-5p-inhibitor对照组；Vehicle control为空白对照组。

1.2.4 Brdu增殖实验检测转染后CRC细胞增殖能力收集转染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5p-mimics、mimics-NC、inhibitor-NC 48h 后的 SW-480、HT-29、HCT-116细胞，制成细胞悬液并计数。在24孔板中添加培养基并加入生长细胞，将细胞悬液以1～2万个细胞/孔加入到24孔板中。加Brdu孵育1h，浓度10μmol/L。在室温下进行细胞固定、0.25%TRITONTM X-100/PBS通透、2mol/L HCL变性等操作。用1%BSA/PBS稀释Brdu抗体进行一抗孵育2h，温度37℃。用1%BSA/PBS稀释荧光二抗进行二抗孵育45min，温度37℃，避光。在室温状态下用DAPI进行染核10min，避光。PBS洗5min，重复2次。Brdu能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中，然后用荧光标记的Brdu抗体进行染色，并在荧光显微镜下观察荧光染色细胞比例，显示荧光的细胞即增殖的CRC细胞。

1.2.5 流式细胞仪检测转染后CRC细胞凋亡率 将转染48h后收集的细胞，接种至细菌培养板中培养条件改为2%FBS的完全培养基（诱导凋亡条件），通过胰酶细胞消化、培养箱孵育、离心等操作后，加入Annexin VPE/7-AAD进行染色，1h内通过流式细胞仪进行检测，用荧光显微镜观察，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片再行观察。流式凋亡图左下为正常细胞，左上为早期凋亡细胞，右上为晚期凋亡细胞，右下为碎片、损伤细胞、坏死细胞。

1.2.6 划痕实验检测转染后CRC细胞迁移能力 收集转染成功的HT-29细胞，制成细胞悬液并计数。转染前1d用枪头在24孔板背后，用直尺比着、均匀地划横线，每隔0.5～1cm划一道线，横穿过孔。用200μl枪头比着直尺垂直划痕，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃、5%CO2培养箱进行培养。在 0、6、12、24h的时点进行取样、拍照；使用 ipwin32软件进行面积和长度的分析，计算宽度值。

1.2.7 Western blot法检测PIK3R1蛋白表达 转染miR-455-5p-inhibitors、miR-455-5p-mimics、mimics-NC、inhibitor-NC 48h后收集细胞沉淀，用0.01mol/L的PBS冲洗3次，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解，离心，取上清液，测定总蛋白浓度。上样完毕后，用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，在4℃条件下23V电压湿转12h。取下转膜后的膜，用PBST洗涤4次，5min/次。将膜置于质量百分比为5%的脱脂奶粉中，室温封闭，37℃1h。膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用PBST洗膜4次，5min/次。膜在稀释二抗中37℃反应1h，室温孵育1h。TBST漂洗5min×6次。暗室内浸入ECL液显色并使胶片曝光，洗片。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件，计量资料用表示，两组比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-455-5p在组织中的表达情况 miR-455-5p在CRC组织中的相对表达量为0.59±0.34，明显低于癌旁正常黏膜组织的2.45±1.60，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 1。

2.2 miR-455-5p表达水平与临床特征的关系 不同肿瘤分化程度的CRC患者miR-455-5p表达水平的差异有统计学意义（P＜0.05）；但不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分型、TNM分期、有无淋巴转移的CRC患者miR-455-5p表达水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。

图1 miR-455-5p在CRC组织及癌旁正常黏膜组织中的相对表达量

2.3 miR-455-5p转染CRC细胞的结果 将未转染细胞作为空白组，转染mimics-NC作为阴性对照组，转染miR-455-5p mimics作为阳性对照组。结果显示miR-455-5p表达均能在 SW480、HCT-116、HT-29 细胞上下调，即转染成功，阳性细胞比例为70%～80%，见图2。

2.4 miR-455-5p对CRC细胞增殖的抑制作用 3株转染后的细胞进行Brdu增殖检测，结果显示：下调miR-455-5p 后，可促进 SW480、HCT-116、HT-29 细胞增殖；上调 miR-455-5p后，可抑制SW480、HCT-116、HT-29细胞增殖，见图3。

2.5 miR-455-5p对CRC细胞凋亡的促进作用 与inhibitor-NC比较，转染miR-455-5-inhibitor可抑制SW480、HCT-116、HT-29 细胞凋亡 （均P＜0.05）；与mimics-NC比较，上调miR-455-5p可促进HT-29、HCT-116细胞凋亡（均P＜0.05），而SW480的凋亡差异不明显（P＞0.05），见图4和图5（插页）。

表2 miR-455-5p表达水平与临床特征的关系

图2 miR-455-5p转染3株CRC细胞的荧光图

图3 miR-455-5p对CRC细胞增殖的抑制作用（*P＞0.05）

2.6 miR-455-5p抑制CRC细胞迁移 HT-29细胞划痕24h后，与inhibitor-NC比较，抑制miR-455-5p可促进HT-29迁移；与mimics-NC比较，上调miR-455-5p可抑制HT-29迁移，见图6。

图4 流式细胞仪检测转染后CRC细胞凋亡情况

图6 HT-29细胞划痕结果

2.7 验证miR-455-5p对PIK3R1表达的影响 为进一步明确miR-455-5p对肠癌细胞增殖的分子机制，通过 Target Scan、miRNA da和 Pic Tar等 3个在线miRNA靶基因预测软件对miR-455-5p的靶基因进行预测。根据靶基因预测数据库确定miR-455-5p与靶基因PIK3R1 mRNA 3'UTR的结合区域。qRT-PCR检测转染48h后CRC细胞中PIK3R1的表达，结果显示：抑制miR-455-5p可促进CRC细胞PIK3R1基因mRNA水平表达；上调miR-455-5p可抑制CRC细胞PIK3R1基因mRNA水平表达。应用Western bolt法检测PIK3R1蛋白表达情况，结果显示：抑制miR-455-5p可促进3株CRC细胞PIK3R1蛋白表达；上调miR-455-5p可抑制3株CRC细胞PIK3R1蛋白表达，见图7（插页）。

3 讨论

自从1993年Lee等[4]首次在秀丽隐杆线虫体内发现一种可以调节其发育进程的RNA（lin-4）后，miRNA逐步进入研究者的视野。它是一类内源性非蛋白质编码的RNA分子，广泛分布于病毒、植物以及高等哺乳动物中。mRNA的表达即使出现轻微的变化，也会引起mRNA转录后水平的变化。因此miRNA是继转录分子之后，又一个具有调节作用且与肿瘤存在密切关系的内源性调控分子。CRC的发生是一个多基因异常的过程，随着研究的不断深入，越来越多的分子生物学标志被证实与CRC的发生有关[11-15]。miR-21是首个在人体体液中发现的miRNA，Toiyama等[16]通过对比分析186例肠癌组织、43例高级别腺瘤组织及53例正常对照组织，发现血清miR-21表达水平随着临床分期呈阶梯状升高，且其灵敏度和特异度均较高，认为其可作为CRC的筛查指标；该研究还发现miR-21表达水平可作为影响CRC患者生存的独立预后因素。Slaby等[17]发现在CRC组织中，miR-145表达水平明显下调，且与肿瘤体积、TNM分期有着临床相关性，认为miR-145作为抑癌因子在肠癌发展过程中起着重要作用，尤其是在腺瘤恶变为腺癌的过程中。miRNA与CRC间的这种关系，为CRC的预防、诊断和治疗提供了新的思路。

目前有研究发现miR-455-5p以抑癌基因的形式存在多种肿瘤中，且呈低表达状态；但关于miR-455-5p在CRC的表达及与结肠癌关系的研究并不多。Yang等[18]研究发现，miR-455-5p作用癌基因通过靶向调控galectin-9在结肠癌中发挥作用。但Yang等[18]的研究入组标本只有10例结肠癌组织，样本量较少，因此该研究对miR-455-5p在结肠癌中所发挥的作用并不能完全明确。而本研究扩大样本量，同时纳入CRC癌旁正常黏膜组织来明确miR-455-5p的作用。研究发现，与正常黏膜组织比较，miR-455-5p在CRC组织中呈低表达。进一步分析患者的临床特征，发现miR-455-5p的相对表达量与肿瘤分化程度可能存在相关性，表明不同肿瘤分化程度对患者的诊断、治疗及预后有着重要作用，提示miR-455-5p可能参与了CRC的分化过程。

肿瘤的发生主要由于细胞增殖凋亡的失控。本研究结果显示，上调miR-455-5p可抑制CRC细胞的增殖，促进CRC细胞的凋亡，抑制CRC细胞的迁移，这表明miR-455-5p具有抑癌作用。细胞永生化是肿瘤细胞的一大特性，而造成这个特性是由于细胞的增殖和凋亡，过表达miR-455-5p会影响CRC细胞的生长。本研究中miR-455-5p在SW-480中凋亡不明显的结果，尚不能断定是miR-455-5p对SW-480细胞凋亡无影响还是miR-455-5p表达量太低所致，有待进一步探讨。进一步研究miR-455-5p调控CRC细胞的增殖和凋亡的可能机制，笔者通过多个靶基因预测数据库找到了miR-455-5p的一个潜在靶基因PIK3R1。PIK3R1是PIK的调节亚基p85a，各种信号分子都要与p85a亚基结合才能激活PI3K，而PI3K家族属于原癌基因，是肌醇与磷脂酰肌的作用激酶[19-20]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K的主要下游效应分子之一，可直接通过磷酸化多种转录因子发挥作用。PIK/Akt信号通路参与调控多个转录因子，在肿瘤发生、发展过程中起着重要作用[21]。PIK在PDK1的辅助下上调Akt激活信号通路，Akt通过调控下游mTOR、XIAP、Mdm2等靶蛋白，进而启动凋亡周期、促进细胞侵袭等生物学行为。已有研究发现PIK/Akt信号通路在许多肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤的发病机制中发挥重要作用。本研究发现上调miR-455-5p可抑制PIK3R1 mRNA和蛋白的表达，进一步证实了PIK3R1基因是miR-455-5p的功能性靶基因，而miR-455-5p是否通过调控PIK3R1通路来调控CRC的发生、发展有待进一步研究。目前已有研究证实PIK上调可影响结肠癌的进展[22]。

综上所述，miR-455-5p在CRC组织中呈低表达，其生物学特性是miR-455-5p具有抑制CRC细胞生长的作用。通过靶基因预测软件及Western blot实验证实PIK3R1是miR-455-5p的靶基因之一，而miR-455-5p发挥抑癌基因的作用机制可能与调控PIK3R1的表达有关。

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