rhPTH（1-34）对糖皮质激素性骨质疏松症的防治作用

孙平 邢强强 洪郭驹 杨国柱 刘楠 孙伟珊 胡伶平 邓伟民 马承红

广东药科大学附属第一医院1骨内科，5内分泌科（广州510080）；2山东省青岛市即墨区人民医院护理部

（山东青岛 266200）；3广州中医药大学附属第一医院骨科（广州510504）；4广东药科大学生命科学与生物制药学院（广州510006）；6广州军区广州总医院康复科（广州510010）

糖皮质激素性骨质疏松症（Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是继发性骨质疏松症最常见的原因，其发病率仅次于绝经后骨质疏松症及老年性骨质疏松症而位居第3位［1］，受到广泛关注。GC可抑制骨形成，因此，促合成代谢药物是GIOP治疗领域的研究重点。甲状旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）是目前唯一具有促进骨形成的药物，可针对性地防治GIOP，但其具体机制尚不明确。甲状旁腺素相关肽［parathyroid hormone-related peptide 1-34，rhPTH（1-34）］间断小剂量注射可增加BMD、改善骨微结构、降低骨折风险［2］。Wnt信号通路中β-catenin、wnt10b蛋白与GIOP的发生密切相关。鉴于此，本文建立大鼠GIOP模型，采用qRT-PCR和Western blot等检验方法，探讨Wnt信号通路相关蛋白在BMSCs成骨分化过程中的作用，为其防治GIOP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料3月龄SPF级雌性SD大鼠48只，按照广东药科大学实验中心标准饲养，标准鼠粮适应性饲养（含钙1.19%，磷0.85%，1 045 IU维生素D），室温（23±2）℃，自由饮水，光照和黑夜时间间隔12 h，定期消毒及通风，各组大鼠均单笼培养。

1.2 主要试剂注射用甲强龙（辉瑞公司）；Lipopolysaccharide（Sigma公司）；Protease Inhibitor Cocktail SetⅢ（美国Calbiochem公司）；一抗Wnt10b鼠抗、β-catenin兔抗（Sigma公司）；GAPDH（CST公司）；HRP山羊抗小鼠IgG二抗、HRP山羊抗兔IgG二抗、ALP检测试剂盒、DEPC处理水（上海碧云天生物技术有限公司）；茜素红染色检测试剂盒（广州赛业生物科技有限公司）；PCR试剂盒（ROCHE公司）；PCR引物（生工生物工程上海有限公司）；

1.3 检测仪器与软件TP1020自动脱水机（Leica Biosystems公司）、Autos全自动染色机（Leica公司）；BX53显微镜（Olympus公司）；μCT100柜式锥形束微型CT（Scanco公司）；image-pro plus软件（Media Cybernetics公司）。

1.4 分组及研究方法3月龄SPF级雌性SD大鼠24只，随机分为4组：正常对照组、甲强龙组（模型组）、参照HULLEY等［3］的方法，皮下注射甲强龙（Methylprednisolone，Met）5 mg/（kg·d），每周5次，甲强龙组（Met）+皮下注射生理盐水（空白对照组）、甲强龙组（Met）+rhPTH（1-34）灌胃（试验组）。各组适应性喂养7 d后进入实验期12周。

1.4.1 GIOP造模与干预方法腹部肌肉注射Met 5 mg/（kg·d），隔间24 h连续注射6次。注射Met期间，每天每只大鼠相应腹部处注射青霉素10万U，连续6次，预防感染。腹部注射rhPTH（1-34）按照人的临床等量剂量换算。正常组注射与rhPTH（1-34）等体积的生理盐水。

1.4.2 Micro-CT检测（1）扫描参数：由Scanco公司提供μCT100柜式锥形束微型CT。X线5 μm焦点直径，30～ 90 kVp/20～ 50 keV（160 Μa）；探测器为3 072 × 400；分辨率：1.25 μm，4 μm；图像矩阵：512×512～8 192×8 192。扫描尺寸为100 mm×140 mm。（2）扫描方法：将纳入研究的GIOP大鼠及对照组通过尾静脉空气注射处死，延双侧臀肌外侧切开，暴露双侧股骨头，用咬骨嵌取下左侧股骨头及转子部（不破坏及挤压股骨头部骨小梁）。给予4%多聚甲醛固定2周。将股骨纵轴与显微CT检查床滑轨的移动轴平行近端进行Micro-CT扫描。对Micro-CT扫描图像经校准后手动选取股骨头区域建立三维兴趣区（region of interest，ROI），兴趣区为完整股骨头区域。（3）检测指标：组织体积（tissue volume，TV）、骨体积（bone volume，BV）；在直接测量和三角测量法（triangulation，TRI）模式下，对骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）；并 进 行 三 维重建。

1.4.3 HE染色截取股骨全长并剔除周围肌肉，沿正中冠状面剖开，用10%甲醛溶液（pH=7.4）固定48 h，再置于10%EDTA-Tris缓冲液中脱钙，隔天更换脱钙液，直至完全脱钙以后，流水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，常规HE染色。光镜下观察骨髓腔内骨髓细胞、骨小梁及骨细胞形态等。

1.4.4 GIOP大鼠来源BMSCs与rhPTH（1-34）干预：参照曹华等［4］的方法，选取4周龄SPF级雌性SD大鼠24只建立GIOP模型后（方法同上述动物实验），分离模型大鼠双侧胫骨BMSCs细胞，先在DMEM培养基中培养至细胞密度2×106个/40 μL（DMEM培养基内含100 IU青霉素、100 μg/mL链霉素，三维支架经PBS缓冲液冲洗后置于DMEM培养基中），分别行成骨诱导分化。

1.4.5 染色法检测成骨分化能力将模型组大鼠腹部解剖，收集腹主动脉血液，并进行分离提BMSCs。将BMSCs分为3组，包括空白对照组、50 ng/mL BMP-2（对照组）、20 ng/mL rhPTH（1-34）（试验组）。50 ng/mL BMP-2和20 ng/mL rhPTH（1-34）进行成骨诱导液诱导BMSCs。（1）ALP法检测细胞分化：BMSCs使用胰酶进行消化，以1×104个/mL接种于96孔板（设6个复孔），培养24 h，吸去培养基，加入相应的处理培养基，培养48 h后，根据ALP试剂盒说明书进行检测。（2）钙化结节染色：将BMSCs以1×104mL/孔密度接种于6孔培养板上，培养24 h，根据分组加入相应的含药培养基（2 mL/孔），每种浓度设2个复孔，每72小时换液1次，连续培养21 d，经茜素红染色后，显微镜观察钙化结节形成过程。

1.4.6 Western blot检测从液氮中取出股骨头称重后放入研磨钵中，研磨至粉末状，按50 mg骨组织/200 μL RIPA裂解液制备样品。BMSCs用裂解液裂解细胞，刮净培养板，SDS-PAGE：分别制备10%分离胶、5%浓缩胶，待凝胶聚合后，注入电泳缓冲液。样品裂解液与上样缓冲液按5∶1充分混匀，置沸水浴中加热5 min，冷却后用微量移液器吸取样品与预染蛋白marker点样并电泳。转膜缓冲液中制作滤纸、凝胶、PVDF膜，350 mA转膜3 h。取出PVDF膜置于盛有5%脱脂奶粉的封闭液的平皿中，摇床室温封闭1 h。倾倒封闭液，加入一抗（Wnt10b、β-catenin按1∶1 000稀释，β-catenin、GAPDH按1∶2 000稀释），摇床上室温振荡孵育2 h，孵育过夜。回收一抗，用TBST洗涤3～ 5次，每次10 min。加入相应二抗（1∶1 000）。TBST洗涤3次，每次5 min，TBS洗涤1次，1 min。将发光显色试剂盒中的显色剂A和B等体积混合后，加在PVDF膜上充分接触反应2 min后，将PVDF膜移至另一保鲜袋中，放入凝胶成像系统中进行成像分析。先曝光约3～5 min，根据信号的强弱适当调整曝光时间，分析结果，使用image-pro plus软件进行半定量分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差表示，采用组间两独立样本t检验及方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GIOP模型造模与干预评价建立GIOP模型，模型组：骨小梁稀疏变细，出现骨髓细胞碎片，细胞数目及网状结构较正常稀疏。正常组：骨小梁完整，骨小梁中的骨细胞清晰可见。可见成骨活动较为活跃，骨小梁形态较好（图1）。各组骨小梁与组织体积比比较，试验组与模型组之间差异有显著性（P＜0.05，表1）。

图1 各组大鼠镜下组织病理切片Fig.1 The results of pathological section in difference groups

表1 各组BT/TV比值Tab.1 The radio of bone trabecular and tissue volume of groups ±s

表1 各组BT/TV比值Tab.1 The radio of bone trabecular and tissue volume of groups ±s

注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05

2.2 Micro-CT检测GIOP模型骨微结构模型组与正常对照组相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低，Tb.Sp值升高（P＜0.05）。试验组与模型组相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值升高，Tb.Sp值降低（P＜0.05），空白对照组相应指标与模型组比较差异无显著性（表2）。ROI三维重建可见模型组骨小梁紊乱，可见普遍断裂，骨质较少；试验组相对而言骨质改善，骨小梁有局部性修复，说明rhPTH（1-34）增加GIOP大鼠模型的骨小梁修复和促进微观骨性结构改善（图2）。

表2 各组BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N等参数比较Tab.2 The parameters of BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N of groups ±s

表2 各组BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N等参数比较Tab.2 The parameters of BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N of groups ±s

注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05

2.3 rhPTH（1-34）调控大鼠骨组织Wnt10b、βcatenin蛋白表达试验组的Wnt10b和β-catenin蛋白表达水平较模型组显著增高（P＜0.05），模型组与空白对照组各指标相比，差异均无显著性（P＜0.05，表3）。

2.4 rhPTH（1-34）促进ALP染色和茜素红染色各组经茜素红染色检测矿化结节。BMP-2和rhPTH（1-34）干预后形成的矿化密度均显著高于空白对照组，rhPTH（1-34）处理组矿化密度较BMP-2处理组少，提示rhPTH（1-34）能显著增强BMP-2的矿化能力。与空白对照组相比，rhPTH（1-34）对正常大鼠BMSCs具有成骨诱导作用，可显著提高细胞ALP活性（图3）。

图2 正常对照组、模型组、试验组、空白对照组Micro-CT三维重建影像Fig.2 The results of Micro-CT in difference groups.

表3 骨组织中Wnt10b和β-catenin相对蛋白量Tab.3 The relative protein of Wnt10b and β-cateninin bone tissue ±s

表3 骨组织中Wnt10b和β-catenin相对蛋白量Tab.3 The relative protein of Wnt10b and β-cateninin bone tissue ±s

注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05

图3 各组茜素红染色检测及矿化密度比较（A）；各组ALP染色检测及ALP密度比较（B）（100×）Fig.3 Alizarin red staining and mineralization density results indifference groups；ALP staining and ALP density results indifference groups（100 ×）

3 讨论

正常的骨骼中骨形成和骨吸收之间处于动态平衡，GIOP由于失去了这种动态平衡，以骨形成缺陷为主，成骨减少，骨量降低，机体对骨微损伤的修复能力下降，导致骨的脆性增加，易于骨折。研究表明，每日接受7.5 mg或者更高剂量的GC治疗3个月以上，最终有30%～50%发展为骨质疏松，有超过1/3的绝经后妇女椎体至少发生过1次椎体骨折［5］，由于GC在临床上广泛而长期运用，使得该病的发病率居高不下。因此，如何拮抗GC副作用以有效防治GIOP中骨代谢紊乱具有关键性意义。

目前临床治疗骨质疏松症主要基于促进骨形成、抑制骨吸收和改善骨组织3方面［6］。rhPTH（1-34）是第一个用于临床的具有促进骨形成的治疗骨质疏松症的药物，可增加骨形成，改善骨微结构和强度，并减少骨折的发生［7］，其促骨形成的作用机制，主要认为是rhPTH（1-34）与靶细胞膜上的G蛋白偶联，从而激活一系列信号传导途径，引发细胞内生物学活动，进而影响骨代谢。Wnt信号通路在促进骨形成中发挥着重要作用，Wnt/β-catenin信号通路通过影响成骨细胞的增殖、分化、骨基质的形成和矿化在骨形成过程中扮演重要角色。Wnt信号通路中β-catenin、wnt10b蛋白与OP的发生密切相关。Wnt10b可抑制脂肪细胞生成、促进BMSCs向成骨细胞分化增多，进而促进骨形成，增加全身骨量。GC可通过阻止β-catenin的累积及向核内的转移，增加β-catenin降解，抑制Wnt10b表达，降低骨形成［8］。同时成骨细胞可通过旁分泌方式分泌Wnt10b进一步促进BMSCs向成骨细胞分化，Wnt10b在BMSCs的过表达在体内会使BMD增加，骨小梁的厚度、数量均增加，在体外还可以促进成骨细胞的发生过程［9］。本研究结果显示，给予GC干预后，β-catenin、wnt10b水平模型组较正常对照组显著降低，给予rhPTH（1-34）后，能够显著提高大鼠骨量及Wnt/β-catenin信号转导通路中Wnt10b和β-catenin的表达，使BMSCs向脂肪细胞分化减少而向成骨细胞分化增多，提高成骨分化，促进骨形成，提示rhPTH（1-34）可拮抗GC导致的Wnt10b和β-catenin的降低，进而使骨量增加。本课题另一部分rhPTH（1-34）对GIOP大鼠脂代谢作用的研究正在进行中。

综上，随着GC和经典Wnt信号转导通路研究的深入，rhPTH（1-34）在成骨细胞分化及骨形成过程中的作用机制将进一步被阐明。

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