药用植物三尖杉及其同属易混物种的DNA条形码鉴定研究＊

黄宇航，曾卓尔，成 航，邓 港，骆帅宾，麦倩婷，高 翰，刘 霞＊＊

（1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院 武汉 430070;2.武汉市外国语学校高中部 武汉 430022）

三尖杉Cephalotaxus fortunei Hook.f.是一种药用植物，我国民间将其带嫩枝的叶作为消积、润肺和驱虫药[1]。三尖杉广泛分布于秦岭以南的部分省区，垂直分布从东（约200 m）到西（2 500 m）逐渐升高。一般常与阔叶树、针叶树混杂，呈零星分布[2,3]。三尖杉中含有生物碱和黄酮两大类化学成分[4]，其中三尖杉酯类生物碱具有抗癌活性[5]。20世纪70年代初，Powell等发现三尖杉中的三尖杉酯碱类化合物具有抑制小鼠白血病细胞生长的作用，从而引起人们对其生物碱类成分的广泛研究和重视[6-9]。目前，我国已将三尖杉酯碱（harringtonine,HT）和高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT）开发成抗癌药物，对急性非淋巴细胞性白血病和慢性粒细胞性白血病有较好疗效[10,11]。由于其抗癌功效良好，三尖杉已被过度商业采伐，目前处于渐危状态并且种群数量正在下降[12,13]。

由于三尖杉的药用部位主要为叶，与其他同属近缘物种形态极其相似[14]，使得利用形态特征对三尖杉进行快速、有效鉴别稍显困难[15]。同时，郎学东等[16,17]提出对于三尖杉属植物的系统分类尚存争议，这使得利用已有文献对三尖杉进行形态学鉴定变得更为复杂。经过走访市场发现，其最常见的同属易混物种为粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehd.et Wils.)Li和蓖子三尖杉Cephalotaxus oliveri Mast.。市场上流通的混淆物种会威胁三尖杉的用药安全。目前，针对三尖杉属植物的鉴别方法除有形态学鉴别外，还有显微鉴别[18]和薄层色谱分析[19]等。上述方法均存在不同程度的局限性。所以需要探索一种针对三尖杉及其易混物种高效、快捷的新型鉴定方法。

DNA条形码技术是一种利用基因中相对较短的特异性序列来进行物种分类学鉴定的分子生物学技术[20]。该技术与传统鉴定技术相比，在物种鉴别时具有高稳定性、高准确性的特点[21]，对于保障中药材用药安全准确具有重要意义[27]。目前，该技术已经在植物系统学分类等领域得到广泛应用，并已成功应用于蔓荆子、车前子、羌活等多种中药材的鉴别中[22-26]，但目前尚未发现运用DNA条形码技术鉴定三尖杉的相关报道。本研究基于DNA条形码技术，探索ITS2和psbA-trnH序列作为三尖杉及其属内易混物种条形码序列的可行性，以规范三尖杉药材的选用，保障其用药安全。

表1 采集样品信息表

1 材料和方法

1.1 材料

本实验通过野外考察等方式收集三尖杉属3个物种（三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉）共22份植物样本，其中三尖杉6份、粗榧8份、蓖子三尖杉8份，分别来自湖北、云南等地。所有样品均经武汉理工大学楼一层教授鉴定，凭证标本保存在武汉理工大学中药资源与分子鉴定实验室。详细样品信息见表1。本研究另从GenBank数据库下载上述3物种psbA-trnH序列共10条，Genbank登录号见表2。

表2 psbA-trnH下载序列信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

参照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[28,29]，取经硅胶干燥的样品叶片约20 mg，经75%乙醇擦拭后，用高通量组织研磨仪（Sceintz-48，宁波新芝）以30次/min研磨2 min。利用核分离液（2%PVP，20 mmol⋅L-1EDTA，100 mmol⋅L-1PH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol⋅L-1NaCl）800 μL抽提2次后，利用基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.,China）提取DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序

ITS2和psbA-trnH序列PCR扩增引物及反应条件参见《中药DNA条形码分子鉴定》[29]，PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测并对有清晰目的条带的样品进行纯化后，使用ABI 3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.,USA）进行双向测序。

1.2.3 数据处理

利 用 CodonCode AlignerV4.2（CodonCode Co.,USA）对测序峰图文件进行序列拼接和剪切，去除低质量部分。将所得序列采用基于隐马尔科夫模型HMMer注释的方法，在ITS2 database网站进行注释，剪去所得序列的5.8S端和28S端，获得ITS2序列[30-32]。通过与Genbank序列进行Blast比对，并利用参考序列进行注释，获得psbA-trnH序列。使用MEGA 5.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis Co.,USA）软件进行序列比对分析[33]。分别基于两种序列，利用K2P（Kimura 2-Parameter）模型计算各物种遗传距离并分析，构建Neighbor-Joining（NJ）系统聚类树，并采用bootstrap重复1 000次对各分支的支持率进行检验[33]。

2 结果

2.1 三尖杉及其同属易混物种的种内变异分析

2.1.1 基于ITS2序列的种内变异分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的ITS2序列特征见表3。三尖杉共6条序列，长度均为233 bp，以SJ-001为主导单倍型。在132 bp处存在A-C变异；152 bp处存在C-T变异；161 bp处存在T-C变异；175 bp处存在CG变异。平均GC含量为69.30%。粗榧共8条序列，长度为223-237 bp，存在分别以CF-001、CF-003为主导单倍型的2种单倍型。在108 bp处存在G-A变异；在117 bp处存在A-G变异。平均GC含量为66.75%。蓖子三尖杉共8条序列，长度为223-233 bp，存在分别以BZ-001、BZ-007为主导单倍型的2种单倍型。在235 bp处存在A-C变异。平均GC含量为69.50%。

表3 三尖杉及其同属易混物种ITS2序列特征表

表4 三尖杉及其同属易混物种psbA-trnH序列特征表

2.1.2 基于psbA-trnH序列的种内变异分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的psbA-trnH序列特征见表4。三尖杉共10条序列，长度为313-390 bp，以SJ-001为主导单倍型。不存在种内变异位点。平均GC含量为39.90%。粗榧共12条序列，长度为390-490 bp，存在分别以CF-003、CF-005为主导单倍型的2种单倍型。存在99个种内变异位点。平均GC含量为41.10%。蓖子三尖杉除BZ-007扩增失败，共获得9条序列，长度为268-364 bp，以BZ-001为主导单倍型。不存在种内变异位点。平均GC含量为40.00%。

2.2 三尖杉及其同属易混物种的种内及种间遗传距离计算

2.2.1 基于ITS2序列的遗传距离计算

基于ITS2序列，利用K2P模型计算所得的遗传距离见表5。三尖杉的最大种内遗传距离（0.0087）小于与粗榧的最小种间遗传距离（0.7424）、小于与篦子三尖杉的最小种间遗传距离（0.7424），表明可利用ITS2序列将三尖杉与这两个易混物种区分。

2.2.2 基于psbA-trnH序列的遗传距离计算

基于psbA-trnH序列，利用K2P模型计算所得的遗传距离见表6。由于三尖杉和粗榧的最小种间距离为0，与三尖杉种内遗传距离相等，表明利用psbA-trnH序列无法区分三尖杉和粗榧两物种。

2.3 NJ系统聚类树构建

2.3.1 基于ITS2序列的NJ树

应用相似性搜索法，构建了基于ITS2序列的NJ系统聚类树，见图1。图中三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉各自聚为一支，表现出良好的单系性。表明利用ITS2序列作为DNA条形码，可以对三尖杉与其易混物种进行有效鉴定。

2.3.2 基于psbA-trnH序列的NJ树

基于psbA-trnH序列所构建的NJ系统聚类树见图2。图中三尖杉虽与蓖子三尖杉分开，但与粗榧聚为一支。表明利用psbA-trnH序列作为DNA条形码，无法对三尖杉与其两个易混物种进行鉴定。

表5 基于ITS2序列的三尖杉及其同属易混物种遗传距离信息表

表6 基于psbA-trnH序列的三尖杉及其同属易混物种遗传距离信息表

3 讨论

DNA条形码技术作为在生物分类和鉴定领域一项发展迅速的新技术，在保障药用植物用药安全和保护濒危物种等方面具有潜力。本研究基于三尖杉及其2个易混物种共53条序列（ITS2序列22条、psbA-trnH序列31条）进行比对分析，探索利用DNA条形码技术用于鉴定药用植物三尖杉的可行性。

通过ITS2序列分析发现，三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的序列种内变异均较小，作为DNA条形码具有良好的稳定性。三尖杉ITS2序列种内最大K2P遗传距离小于与易混物种的种间最小K2P遗传距离；基于ITS2序列构建的NJ树表明三尖杉能与其易混物种明显区分。而三尖杉的psbA-trnH序列种内最大K2P遗传距离等于其与易混物种的种间最小K2P遗传距离；基于psbA-trnH序列构建的NJ树显示三尖杉无法单独聚为一支。因此，ITS2序列可以作为有效鉴定三尖杉及其易混物种的合适DNA条形码序列，而psbA-trnH序列不适合用于三尖杉及其易混物种的鉴定。确定ITS2序列作为鉴定三尖杉的DNA条形码，对于保障其用药安全和准确性都有一定的意义[34]，同时也为其他近缘药用植物的鉴定提供了思路和经验。

图1 基于ITS2序列的NJ系统聚类树

图2 基于psbA-trnH序列所构建的NJ系统聚类树

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