针灸对CIA大鼠的脾脏单个核细胞IL-17、IL-12表达的影响＊

黄 艳，冯 辉，刘世敏，丁邦友，窦传字，程 玲

（1.上海市针灸经络研究所 上海 200030；2.上海中医药大学附属光华医院 上海 200052；3.上海中医药大学 上海 201203；4.同济大学附属东方医院 上海 200120）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种慢性的关节炎症性病变，属全身性的自身免疫性疾病，位居自身免疫性结缔组织病首位[1]，晚期可见关节活动功能障碍，持续发展则出现关节僵硬和变形，甚至丧失劳动力，继而导致残废。我国患病率为0.32-0.36%，欧美约0.5-1%，女性患者发病的几率是男性的3倍，医疗成本增加[1,2]。生物制剂、NSAIDs和DMARDs等药物是现代医学治疗RA的传统治疗方法，对于炎症抑制有确切的疗效，延缓骨破坏，但需要长期使用，且价格昂贵。在应用免疫抑制剂治疗后，常发生正常免疫功能低下的情况，并可诱发感染[3,4]、肿瘤[5]、血液系统和肝功能损害[6,7]等不良反应。祖国中医药在治疗RA方面具有确切的优势，针灸治疗疾病具有整体调节的特点，有些研究报道了针灸在免疫调节方面发挥的作用[8-11]，余曙光等在研究中发现电针能够增加类风湿关节炎大鼠外周血T淋巴细胞的凋亡率[12]。电针足三里对CIA大鼠可改善大鼠的血液流变学指标，并发现电针可有效抑制CIA大鼠关节炎指数、足跖肿胀度以及血清和炎症局部组织中前列腺素E2（PGE2）含量，控制病情的进一步发展[13]。针灸腧穴具有抗炎免疫作用[14]，其机理与灸疗抑制TNF、IL-1等炎症因子的释放相关，可增强与改善机体的免疫功能[11,15]。艾灸治疗类风湿关节炎大鼠的效应观察及穴位应用研究提示艾灸具有镇痛作用[16,17]，还能明显改善RA大鼠局部滑膜细胞的超微结构，对免疫器官如脾脏、胸腺等具有保护作用[18]。目前针灸改善CIA大鼠关节炎症的机制尚未完全明确，脾脏是机体免疫-神经-内分泌网络调节中心的一个重要组成部分[19]，储备了大量起免疫作用的单核细胞[20]，本研究将从脾脏单个核细胞的角度观察针灸调节免疫炎症因子的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：

本实验选取雌性清洁级Wistar大鼠32只，体重200±20 g，购自中国科学院上海生命科学研究院动物中心，动物生产许可证号为SCXK（沪）2012-0002，动物使用许可证号为SYXK（沪）2008-0050。本实验在上海交通大学医学院实验动物科学部SPF级动物中心完成。饲养环境为12 h昼夜节律交替，室温25±1℃，相对湿度50-70%，适应性饲养1周。

1.2 主要试剂及仪器：

牛Ⅱ型胶原蛋白（美国Chondrex公司）；完全弗式佐剂（CFA，美国sigma公司）；不完全弗式佐剂（IFA，美国sigma公司）；逆转录试剂盒（美国Promega公司）；Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）；特制细艾条（南阳汉医艾绒有限责任公司）；戊巴比妥钠（上海化学试剂厂）；高速低温离心机（HITACHI公司）；实时定量PCR仪（美国PERKIN·EIMER公司）；-80℃超低温冰箱（美国REVCO公司）。

1.3.1 适应症 ①治疗：曲霉菌、念珠菌（包括氟康唑耐药株）等引起的侵袭性真菌病以及宿主因素和GM/G试验阳性驱动的诊断治疗[3-5]；②预防：造血干细胞移植患者、粒缺持续>10d或化疗的血液恶性肿瘤患者、使用免疫抑制剂的器官移植患者、高危HIV感染患者以及腹膜炎患者预防真菌感染[3-5，8，9]。

1.3 CIA大鼠模型的建立：

采用免疫学方法制备胶原诱导型关节炎模型大鼠。配制浓度为4 mg·ml-1胶原溶液，存放于4℃冰箱中并避光搅拌过夜。将4 mg·ml-1胶原溶液与CFA等体积乳化，初次免疫使用浓度为2 mg·ml-1的胶原，注射0.12 ml胶原乳剂（含胶原240 μg）于每只大鼠尾根部皮下；将4 mg·ml-1胶原溶液与IFA等体积乳化，使胶原浓度达到2 mg·ml-1，于初次免疫后第7天进行激发免疫，在大鼠臀背部两侧各皮下注射0.03 ml胶原乳剂（共含胶原120 μg）[21]。

1.4 实验分组和治疗：

治疗4周后对CIA大鼠进行关节炎症评分，组间两两比较显示，艾灸组和针刺组大鼠关节炎症评分明显低于模型组，差异具有统计学意义（P艾灸组=0.000，P针刺组=0.001）。艾灸组CIA大鼠关节炎症评分（5.63±1.99）与针刺组（6.25±2.18）两组之间差异无统计学意义（P=0.156）（见表2）。

根据热传导傅立叶定律，单位时间内通过定截面的热量，正比例于垂直于该截面方向上的温度变化率和截面面积，而热量传递的方向则与温度升高的方向相反。较厚部位对电弧加热部位的冷却作用最强，接头温度下降速度最快，其次是薄壁部位，而细杆的散热速度最慢。

采用Trizol法提取总RNA，各取出1 μl总RNA用于测浓度和纯度，每个样本取2 μg总RNA用于逆转录cDNA，进行实时定量PCR进行检测，根据公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量，用2-ΔΔCT将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异。

1.5 MTT比色法：

脾细胞悬液制备：无菌取脾分成2半，将一半脾脏放置200目不锈钢网上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用注射器针芯轻轻研压撕碎的脾脏，制成单细胞悬液稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色（0.1 ml 0.6%台盼兰+0.1 ml1.7%Nacl液+0.2 ml细胞悬液，混匀），计算细胞存活率，调整细胞浓度为5×105/ml。淋巴细胞增殖反应：将5×105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，培养48-72 h，在培养结束前4-6 h，于培养板各孔内加入5 mg·ml-1MTT液，10 μl/孔。37℃培养4-6 h。1 000 rpm离心10分钟后弃上清，各孔内加入150 μl DMSO，溶解10 min，30 min内用酶标测定仪测OD值，测定波长570 nm。取实验组和对照组三个复孔的OD平均值并计算。

1.6 实时定量PCR：

治疗方法：艾灸组：于初次免疫后第12天，选取双侧阳陵泉、昆仑穴（穴位定位参照林文注《实验针灸学》有关标准确定），采用特制专用动物实验细艾条，点燃后在穴位上方约2 cm处进行治疗（以大鼠出现躁动或前爪脸动作来调整高度），每次每穴温和灸20 min，每天1次，共28天。针刺组：自初次免疫后第12天，采用汉医牌一次性针灸针（规格0.30×40 mm）针刺双侧阳陵泉、昆仑穴，留针20 min/次，每天1次，共28天。模型组和正常组均只做与各干预组相同的抓取与固定。以上固定及干预均在上午9-11点期间完成。昆仑穴（BL60）定位：大鼠后肢外踝与跟腱之间的凹陷中；阳陵泉穴（GB34）定位：大鼠后肢腓骨头下方凹陷中，后三里穴上外侧5 mm。

经过实地走访发现，农村的商业银行在小额信贷的发放方面，并未达到预期的目标，主要由于年利率高出了农户的预期值。同时，受产业投资回报率的限制,农业产业的平均回报率不高，农业生产收益也有很大不确定性，银行对农户及农业制定的贷款利率普遍偏高，这种高利率提高了农户的生产融资成本，加剧了农户融资难的现状[3]，影响了农民的贷款积极性，不利于乡村振兴战略的实施。

1.7 脾脏单个核细胞提取：

再次就是加强社团干部服务意识的培养。在社团干部的培养过程中，要淡化他们的功力心，让他们意识到，社团干部是为社团成员服务的，是为团内的同学服务的，培养他们的服务意识，大局意识。对于部分有虚荣心的社团干部，要及时提醒警告他们，修正自己的错误思想，及时敲响警钟。另外，还可以分散社团干部之间的权力，让社团干部之间互相监督制约，使社团的发展真正走向科学化、合理化。与此同时，要定期对于学生社团干部的行为进行监督，形成一套监督体系，引导大家在社团发展中团结合作，共同促进社团的发展。

1.8 统计学方法：

采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学分析，数据符合正态分布，按照均数±标准差（s）表示，若数据不服从正态分布，以中位数表示。符合正态分布者组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），配对检验方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett's T3法。以P＜0.05作为差异有统计学意义。

表1 实时定量PCR检测基因及引物序列

2 结果

2.1 针灸对CIA大鼠关节炎症评分的影响

将32只CIA大鼠随机分成正常组、模型组、艾灸组、针刺组，每组8只。

表2 各组大鼠治疗前后炎症评分比较（s）

表2 各组大鼠治疗前后炎症评分比较（s）

注：与模型组比较，△P＜0.001

治疗后10.28±1.80 6.25±2.18△5.63±1.99△分组模型组针刺组艾灸组n 8 8 8治疗前6.14±2.12 5.75±1.04 5.38±1.76

2.2 针灸对CIA大鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

由图5结果可见，与正常组比较，模型组TNF-α mRNA的表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组与艾灸组TNF-α mRNA的表达均显著降低（P＜0.01），艾灸组与针刺组组间比较无统计学意义（P＞0.05）。

由图2结果可见，与正常组比较，模型组IL-17 mRNA的表达增加（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，艾灸组和针刺组脾脏IL-17 mRNA的表达均显著降低，有统计学意义（P＜0.01）；针刺组与艾灸组组间比较对大鼠脾脏IL-17 mRNA的表达影响无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠淋巴细胞增殖能力变化

2.3 针灸对CIA大鼠脾脏单个核细胞IL-17、IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA表达的影响

3)当锚固段长度较小时，处于弹性变形阶段锚固剂-围岩界面剪应力可近似认为是均布的。随着锚固长度的增加，锚固始端最大剪应力值逐渐降低，界面剪应力分布不均匀程度增加。

图2 各组大鼠脾脏单个核细胞IL-17 mRNA的表达变化

图3 各组大鼠脾脏单个核细胞IL-12 mRNA的表达变化

IL-12的表达受针刺和艾灸作用的效应结果见图3，与正常组比较，模型组IL-12 mRNA的表达增加（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，艾灸组与针刺组脾脏IL-12 mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）；针刺组与艾灸组组间IL-12 mRNA的表达无统计学差异（P＞0.05）。

由图4结果可见，与正常组比较，模型组IL-6 mRNA的表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组与艾灸组IL-6 mRNA的表达均显著降低（P＜0.01），艾灸组与针刺组组间比较无统计学意义（P＞0.05）。

将无菌条件下取的另一半脾脏剪成小块，研磨后以无菌1′PBS液冲洗，冲洗液置于无菌离心管，加入淋巴细胞分离液5 ml，以1 500 rpm转速离心20 min。用滴管取出中间白色云雾状单个核细胞层，加入无菌1′PBS液，以1 500 rpm转速离心8 min，去除液体，以上步骤重复2次，洗净残余的淋巴细胞分离液。

图4 各组大鼠脾脏单个核细胞IL-6 mRNA的表达变化

使用MTT方法检测CIA大鼠淋巴细胞增殖能力变化，由图1可见，与正常组比较，模型组淋巴细胞的增殖能力增高（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组淋巴细胞的增殖能力下降（P＜0.01），针刺组则显示差异无统计学意义（P＞0.05）。提示艾灸能显著降低脾淋巴细胞异常的增殖能力。

图5 各组大鼠脾脏单个核细胞TNF-α mRNA的表达变化

由图6结果可见，与正常组比较，模型组IFN-γ mRNA的表达增加（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，艾灸组和针刺组脾脏IFN-γ mRNA的表达均显著降低（P＜0.01）；针刺组在下调大鼠脾脏IFN-γ mRNA的表达上优于艾灸组（P＜0.05）。

①应根据当地气候、地形、地质等自然条件和社会经济特点，合理规划布局集流节灌工程。集流工程、蓄水工程、输水工程和节灌工程要统一布置，相互衔接配套。

图6 各组大鼠脾脏单个核细胞IFN-γ mRNA的表达变化

3 讨论

类风湿关节炎（RA）是一种手足对称小关节的慢性炎症病变，有反复发作、致残率高的特点，是难治性疾病之一。RA属于中医“痹症”范畴，病因病机为正虚邪侵，虚实夹杂，正气虚损，腠理不固，致使风寒湿热之邪乘虚而入，壅塞经络，久而为痹。针灸能有效治疗RA，缓解局部疼痛，改善关节活动，可疏通经络、活血逐痹[11,22,23]。本实验取阳陵泉、昆仑穴。阳陵泉穴，为胆经之合穴、胆之下合穴。《针灸大成》言：“阳陵泉穴……主膝伸不得屈，髀枢膝骨冷痹，脚气，膝股内外廉不仁”。《铜人腧穴针灸图经》中记载阳陵泉穴具有“治膝伸不得屈，冷痹脚不仁”的作用。昆仑穴为足太阳膀胱经的经穴，针灸昆仑穴可通利经脉气血，可奏通则不痛之效，发挥抗炎镇痛的作用[22]。

现代研究已证实针灸对人体各系统有广泛的双向良性调节作用，可通过调整内分泌功能，改善机体的特异性和非特异性免疫功能[11,23]。临床上应用针灸治疗类风湿关节炎也比较普遍，有肯定的疗效[24-28]，同时也有较肯定的动物实验证据，在CIA大鼠发病前施灸，大鼠的平均关节炎指数和组织病理学损害指数均显著降低[10-12,28,29]。电针能减少CIA大鼠血清TNF-α、IL-1β和ICAM-1的含量[30]。针刺疗法治疗RA多配合灸法，灸疗能减轻关节炎大鼠模型关节滑膜细胞的充血水肿，炎细胞浸润，滑膜细胞增生，组织增生等渗出性病变，从而达到抗炎和增强免疫作用的主要机制[31]。在本实验中发现艾灸能减少CIA大鼠关节炎症评分，艾灸具有通痹止痛、温经散寒的作用，利用艾绒或艾条点燃后热力温和而持久，易于渗透肌肤，利用艾火的热力和艾条的药物作用，在局部取穴，通过经络的传导，疏风通络，运行气血，扶正祛寒，以达濡润温煦筋肉的作用。

RA的发病与炎症因子的作用密切相关。IL-17是一种Th17细胞分泌的重要的前炎症细胞因子，IL-12是介导Th1细胞免疫应答中关键的细胞因子，其在RA患者体内均高表达[32,33]。研究发现伴随RA患者IL-17高表达的还有IL-12、IFN-γ和IL-6的浓度，均显著高于正常组，且中、重度活动组血清IL-6、IL-17水平显著高于低疾病活动组，参与RA的发病并影响RA患者疾病活动[33-35]，降低炎症因子的水平有助于治疗RA。针灸对机体的影响是通过调控神经-内分泌-免疫网络共同介导物质来实现的。针灸干预RA的研究多关注RA外周血炎症因子的浓度，对脾脏单核细胞炎症因子的研究尚不明确。在本研究中发现艾灸或针刺CIA大鼠的阳陵泉和昆仑穴后，各治疗组脾脏单个核细胞IL-17、IL-12、IL-6、TNF-α和IFN-γ炎症因子的mRNA表达均下降，显示出针刺或艾灸能有效抑制CIA大鼠的炎症因子表达，从而起到调节机体免疫的作用。近期研究中发现针灸电针佐剂性关节炎大鼠“足三里”和“昆仑”穴可降低脾脏细胞IL-6活性[36]，隔物温和灸能够降低TNF-α含量[37]，逆灸对随后佐剂性关节炎早期和继发期关节组织的保护作用可能与其降低异常升高的炎性细胞因子IL-1β、TNF-α有关[38]。在类风湿关节炎的免疫反应和组织损害过程中，炎症因子IL-1β和TNF-α发挥了协同致病作用[39]，IL-6可由T淋巴细胞、单核细胞和成纤维细胞产生，在调节免疫应答、急性期反应、促进骨髓造血等方面均有重要作用。RA患者滑液中IL-6的水平显著升高，与RA疾病活动指数相关[40]。因此，针灸能通过抑制脾脏单个核细胞IL-17、IL-12、IL-6、TNF-α和IFN-γ炎症因子的产生，是治疗RA的重要有效方法，具有免疫调节作用。

脾在免疫性疾病的发生发展中起重要的作用，对机体内环境的稳定具有重要的调节作用。以脾脏为切入点，从免疫炎症因子的表达研究针刺和艾灸干预CIA大鼠的效应，发现针灸能调节脾脏单个核细胞多种炎症因子的表达，缓解关节炎模型大鼠体内的免疫炎症反应，为我们进一步了解机体免疫功能提供了思路和线索。

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