鸡免疫禽流感（H5+H7）二价灭活苗后的抗体监测

黄西梅，黄金山，李佳荣，卢莲珍

（1.广西百色市右江区动物疫病预防控制中心，百色 533000；2.百色农业学校，百色 533000）

2017年，按农业部的疫情通报，随着家禽高致病性的H7N9流感病毒株的出现，陆续有鸡群感染高致病性H7N9流感病毒引起大量的死亡，高致病性H7N9流感呈现出区域性流行的态势。H5亚型高致病性禽流感的流行趋势总体平稳，未出现大范围的暴发，但仍有局部散发疫情的发生。H5和H7亚型禽流感在我国同时流行且流行毒株复杂多样，严重威胁着我国家禽养殖和公共卫生的安全，使得疫病防控形势更加严峻。

目前，疫苗免疫是预防和控制禽流感发生的最有效途径，而免疫后抗体水平的高低是评估实际免疫效果的重要指标[1]。

右江区为了抓好家禽H7N9防控，于2017年8月开始推出使用禽流感（H5+H7）二价灭活苗[2]，为了掌握禽流感（H5+H7）二价灭活苗在右江区当地家禽品种的不同注射部位产生的免疫应答和抗体消长情况，提供可操作的免疫方法和免疫程序。特进行本次试验研究，供广大养殖户和动物防疫工作者参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验疫苗

重组禽流感（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），批号 2017024，哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.1.2 试验鸡群分组及免疫次数情况

选用14日龄右江区本地土鸡 100只，分为2组，其中颈部皮下注射2组，胸部肌肉注射2组。共4个组，试验期 105 d，详见表1。

表1 实验动物分组情况

1.1.3 试验鸡群免疫时间和免疫剂量情况

2017年8月20日对 14日龄的鸡2个试验组进行第1次免疫，免疫剂量按疫苗说明书使用，鸡0.3 ml/ 只，9月17日对第 2 组 42日龄的鸡进行第2次免疫，免疫剂量按疫苗说明书使用，鸡 0.5 ml/ 只，详见表1。

1.1.4 血清样品

对第1试验组鸡群1次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 分别随机采集血清各 50 份，第2组2次免疫后，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、60 d、75 d、90 d 的 各 组分别随机采集血清各 50 份，共计血清样品 900 份。

1.1.5 诊断试剂

HI 试验禽流感病毒H5亚型（Re－8株）抗原，批号2017001，阳性血清（批号 2016003） HI 试 验禽 流 感 病 毒 H7 亚 型 抗 原、批号 2017012，阳性血清（批号 2017004）以上试剂均由哈尔滨维科生物技术开发公司生产，1% 的非免鸡红细胞自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法

鸡 1～2 组在 14日龄免疫注射疫苗 0.3 ml，鸡 2组 42日龄免疫注射疫苗 0.5 ml。

1.2.2 采血部位

21日龄以下的鸡鸭在心脏采血，28日龄以上的鸡鸭在颈静脉采血。

1.2.3 检测方法

按照 GB/T18936—2003 颁布的高致病性禽流感诊断技术方法[3]，用 96 孔微量反应板进行微量血凝抑制（Heamoglutination Inhibition，HI）试验，试验用抗原稀释倍数为 4HAU，以完全抑制 4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。并按常规方法设置阴性和阳性对照。

1.2.4 结果判定

只有阴性对照孔血清滴度不大于 22，阳性对照孔血清误差不超过 1 个滴度，试验结果才有效。

HI 价小于或等于 22判定 HI 试验阴性；HI 价等于23为可疑，需重复试验；HI 价大于或等 24为阳性，判为免疫合格。

2 结果与分析

2.1 免疫抗体

“H5+H7二价灭活疫苗”免疫后可刺激机体产生良好的免疫应答，进而产生高水平的免疫抗体。“（H5+H7）二价灭活疫苗”在一免后 14 d可产生较高的抗体、35 d达到抗体峰值，到 60 d仍维持较高的抗体水平。

2.2 不同免疫次数的抗体效价分布情况

通过表2 可知，鸡二免后H5和 H7抗体合格率为 97.8%和94.4%，而一免的只有 72.22% 和 67.56%，差异极其显著（P＜0.01）。通过比较不同免疫次数的抗体效价分布情况，发现二免后的鸡禽流感H5和 H7抗体平均滴度为 8.81 和 7.64 ，比一免高 4.05 个滴度和3.61个滴度，详见表2、3。

表2 1组免疫后抗体的检测结果统计

表3 2组免疫后抗体的检测结果统计

免疫后H5N1Re-8株HI抗体消长曲线

免疫后H7N9－Re1株HI抗体消长曲线

通过绘制鸡一免和二免后的抗体消长曲线，而鸡在一免后 21 d抗体方能合格，并且持续到一免后 90 d均合格。而在二免后的各个时间点采血，抗体均维持高水平，详见表2、3。

2.3 两者的差异

相比之下，H5N1-Re-8株的HI抗体效价比H7N9-Re1株的高，这应与不同病毒2株之间的不同特性有关，所以，在检测HI抗体进行免疫评估时要注意两者的差异。

3 讨论与结论

目前，疫苗免疫是防止禽流感暴发的主要措施。因此，我们进行了禽流感灭活疫苗对鸡的抗体产生规律的探索，为制定禽流感免疫程序和防控禽流感提供科学依据。

本研究发现，“H5+H7二价灭活疫苗”免疫应答性显著，临床使用安全。家禽进行一次免疫后，21 d起平均抗体滴度能达到 4log2 以上，但总抗体合格率基本在 60%～70%，总平均抗体滴度在 4log2 左右，而二次免疫后，总抗体合格率能达到 95% 左右，平均抗体滴度在 8log2 左右。在对家禽进行首次免疫后由于免疫系统是初次应答，加上母源抗体的干扰，因而抗体效价普遍低；由于在首次免疫后，机体对此种疫苗已具有免疫记忆，当再次用此种疫苗进行加强免疫时，机体可迅速产生比上次免疫更多的抗体，故抗体的效价普遍较高。但在生产中：一方面，很多养殖户防疫意识不强，认为由于饲养周期短，免疫过一次就可以达到预防目的，对防疫人员进村入户开展二免不配合不支持，产生抵触情绪；另一方面，在给家禽注射疫苗时，由于抓捉和注射疫苗时疼痛与疫苗的副作用，家禽应激反应很大，可导致生产性能下降和饲养成本的增加。家禽只进行一次免疫，必然造成抗体滴度较低的现象，难以保护家禽群体，潜在受野毒攻击暴发疫情的威胁。应加大对养殖户和防疫员的培训力度，强化防疫意识，确保免疫质量。结合本试验研究结果，推荐右江区在14日龄首次免疫禽流感（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），颈部皮下注射鸡 0.3 ml，42日龄二次免疫禽流感（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株），颈部皮下注射鸡 0.5 ml，使鸡群在较长时间内保持较高的抗体水平。鉴于（H5+H7）二价灭活疫苗”刚刚推出使用，需要对其免疫效果加强评估。

[1] 吴庭才，张春杰，郭务鹏,等．禽流感母源抗体消长规律和免疫保护抗体临界值的测定[J]．广东畜牧兽医科技，2007，32（3）：24-28．

[2] 中华人民共和国农业部，农业部《关于切实做好广东广西H7N9免疫工作的通知》（农办医[2017]23号）．

[3] GB/T18936．高致病性禽流感诊断技术[S]．北京:中国标准出版社，2003．

[4] 刑清洁，景建江，杨雪珍,等．H5+H7禽流感疫苗免疫抗体检测试验报告[J]．今日畜牧兽医，2018（1）：46．