仔猪断奶应激对肠道功能和组织结构影响的研究

于光辉,姜建阳,王西彤,张华杰,耿 梅,宋春阳

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东 青岛 266109;2.威海市动物疾病控制预防中心,山东 威海 264200)

仔猪断奶是其生长发育过程中的一个必经阶段,母子分离、营养和环境改变而造成体内稳态失调[1]。通过添加一些营养性饲料添加剂、药物、植物提取物、微生态制剂等都能缓解断奶应激,并且在生产上也取得了良好的效果,但是始终没能全面、深入地揭示仔猪断奶应激的分子机制。众所周知,中国地方品种猪经过几千年的遗传进化,有着丰富的遗传多样性,它们更能适应当地的气候环境,并且比国外品种有独特的抗逆性,断奶应激反应相对较小。莱芜猪是我国一个优秀的地方品种,与国外品种相比具有抗病力强和肌内脂肪含量高等优异的性状[2];杜长大是养猪生产中常用的杂交组合,能够表现出很好的生产成绩。利用品种对比来研究仔猪断奶应激,探索断奶应激对肠道功能和组织变化是本研究的出发点,这将进一步揭示仔猪断奶应激的差异,为以后抗断奶应激猪的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验选择同一日龄出生的健康杜长大仔猪和莱芜猪各10头(同一窝)作为试验动物。

1.2 试验设计 试验进行42 d,两品种均于28日龄断奶。每个品种为1个处理,分别于仔猪断奶前1 周(21 d)、断奶当天(28 d)、断奶后1 d(29 d)、断奶后1周(35 d)及断奶后2周(42 d)时每个品种每个阶段选取2头仔猪屠宰取样,所有试验猪进行相同的饲养和管理。

1.3 饲养管理 猪的饲养试验在青岛农业大学学生教学实习基地进行,仔猪出生第2天补铁,第5天开始补饲,第28天时断奶,将其转入保育室饲喂全价料,自由采食和饮水。

1.4 样品采集 于仔猪断奶前1周、断奶当天、断奶后1 d、断奶后1周及断奶后2周时每个品种每个阶段选取2头体重相近的仔猪,于当日早晨9:00称重后放血致死,打开腹腔立即结扎幽门瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止消化道样品的相互污染。迅速取出小肠置于预先冰冷的生理盐水中,取出胰腺剥离脂肪组织和结缔组织并称重后,立即放入液氮速冻,然后移入-80℃冰箱中保存备用。取十二指肠近端、空肠前段、空肠后段、回肠中段、盲端的食糜于离心管中,迅速放入液氮速冻,然后转入-80℃冰箱中保存备用。剪取十二指肠中段、空肠前段的肠道组织2 cm左右,浸入4%甲醛中进行固定。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 消化酶活性 分别测定胰腺蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、空肠前段的蔗糖酶和乳糖酶活性,并计算酶活性。胰腺上清液的制备:准确称取一定量的胰腺组织,按重量体积比(w/v)加9倍体积的匀浆介质,在冰浴条件下2 500 r/min离心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷冻保存待测。蔗糖酶、乳糖酶粗酶液的制备:准确称取一定量的肠道食糜,按重量体积比(w/v)加9倍体积的匀浆介质,在冰浴条件下2 500 r/min离心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷冻保存待测。各种酶活的测定都采用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒,并用分光光度计进行测定。

1.5.2 组织切片观察 甲醛固定好的肠道组织用石蜡包埋后做成石蜡切片,经高碘酸-雪夫染色反应后进行观察。用带有测微目镜的显微镜(Olympus,BX51,Japan)计量小肠绒毛长度和隐窝深度,每个组织计量10次取平均值。

1.6 数据统计分析 两品种间和品种内不同时期的数据用SAS软件GLM过程进行方差分析,数据表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 消化酶活性 动物的消化酶活性是胃肠道功能的重要表现形式,两品种仔猪断奶前后消化酶活性见表1。

由表1可见,两品种间的比较表明,两品种仔猪的胰腺蛋白含量在断奶前1周差异不显著,但是在断奶后1 d和1周莱芜猪比杜长大分别高41.94%(P<0.01)和81.48%(P<0.01),到断奶后2周又差异不显著(P>0.05)。胰蛋白酶的活性莱芜猪比杜长大在断奶当天、断奶后1 d、1周和2周分别高4.07%(P<0.05)、21.44%(P<0.01)、57.10%(P<0.01)和34.80%(P<0.01);但是莱芜猪胰脂肪酶的活性只在断奶前1周、断奶当天和断奶后1 d比杜长大差异显著(P<0.05或者P<0.01);胰淀粉酶也呈相同的趋势。莱芜猪的乳糖酶在断奶后1 d和1周比杜长大低37.12%(P<0.05)和22.93%(P<0.05),但是在断奶后2周比杜长大高39.98%(P<0.01)。

从不同断奶时期的比较来看,莱芜猪的胰腺蛋白含量在断奶当天比断奶前1周增加了46.67%,但是断奶后1 d、1周和2周比断奶当天分别降低42.86%(P<0.01)、4.55%(P<0.05)和 8.44%(P>0.05);杜长大仔猪胰腺蛋白含量也呈相同的趋势。胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶、蔗糖酶、乳糖酶的活性在断奶后都呈下降的趋势,但是莱芜猪的消化酶活性比杜长大下降幅度要小些,或者能够在较短时间内很快上升。

2.2 肠绒毛长度和隐窝深度 两品种仔猪断奶前后十二指肠和空肠肠绒毛长度和隐窝深度变化情况见表2。

由表2可见,两品种间比较结果表明,莱芜猪十二指肠绒毛在断奶前1周比杜长大高17.03%(P<0.05),断奶后1 d差异不显著,但是断奶后1周又比杜长大高73.62%(P<0.01)。莱芜猪的空肠绒毛在断奶前1周、断奶后1 d和断奶后1周比杜长大分别高14.24%(P<0.01)、10.69%(P<0.01)和65.63%(P<0.01)。两品种仔猪十二指肠的隐窝深度在断奶前1周和断奶后1 d差异不显著,但是莱芜猪在断奶后1周比杜长大要浅6.14%(P<0.05)。莱芜猪的隐窝深度断奶后1 d比断奶前1周增加9.59%(P>0.05),断奶后1周比断奶后1 d降低1.55%(P>0.05);而杜长大断奶后1 d比断奶前1周降低2.00%(P>0.05),断奶后1周比断奶后1 d增加13.93%(P<0.01)。莱芜猪空肠的隐窝深度比杜长大在断奶前1周、断奶后1 d、断奶后1周分别要深24.08%(P<0.01)、16.77%(P<0.01)、3.65%(P>0.05)。

表1 断奶对不同品种仔猪胰脏蛋白含量及消化酶活性的影响

2.3 断奶前后肠道组织结构 两品种仔猪断奶前后十二指肠和空肠肠道发育的变化见图1。

由图1可见,两品种仔猪在断奶前1周十二指肠和空肠的肠绒毛长度差异不明显,都呈规则的手指状,且肠绒毛排列紧密有序(A1和B1);断奶当天变化不大(A2和B2);断奶后1周莱芜猪的十二指肠绒毛出现空泡化(A3),杜长大的十二指肠绒毛有部分断裂或者脱落(B3);莱芜猪的空肠绒毛变粗变短(A4),杜长大的空肠绒毛脱落严重,并且比莱芜猪的更短(B4)。

3 讨论

3.1 仔猪断奶应激影响猪的生产性能 仔猪断奶母子分离导致仔猪严重的应激反应,并且会挫伤肠道和免疫系统的功能,在断奶后第一周尤为严重,影响仔猪的健康、生长、采食量等。生产中采取各种措施来应对仔猪的断奶应激,如改善生活环境、提高营养水平、增强机体免疫、改变管理模式等,在一定程度上缓解了断奶应激[3]。

3.2 仔猪断奶应激降低消化酶活性 消化酶活性降低是引起断奶仔猪腹泻的主要原因,胰腺是最重要的消化器官之一,分泌多种消化酶,如胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等。仔猪断奶应激降低胰腺的分泌能力和消化酶的活性[4]。胰脂肪酶活性在断奶后逐渐降低,在断奶后2周回复正常水平(表1)。仔猪断奶后1 d小肠蔗糖酶活性迅速下降(大约下降85%),断奶后2 d比断奶后1 d下降30%左右[5]。

表2 断奶前后不同品种猪肠道绒毛和隐窝变化

图1 仔猪断奶前后肠道组织变化图

3.3 仔猪断奶应激影响肠道组织结构 仔猪断奶前,绒毛高度随日龄增长逐渐变长,隐窝深度变浅。断奶后,食物由液体母乳向固体饲料转变,固体饲料中存在抗营养因子及抗原蛋白引发过敏反应,表现为绒毛高度降低,隐窝深度加深[6-7],绒毛高度/隐窝深度的比值显著降低。小肠绒毛高度和隐窝深度的比值决定了仔猪肠道的消化吸收能力,比值越大,表明肠道吸收面积越大,消化吸收能力越高[8]。断奶24 h后肠绒毛高度降低25%,5 d内绒毛高度继续缩短,隐窝加深,到第5天时,降低为原来的50%,随后开始逐渐恢复[9]。隐窝深度能够反映细胞的形成能力,浅的隐窝深度加快了细胞的成熟,提高肠道的分泌能力[10]。本试验结果表明,肠绒毛在断奶后1周逐渐降低,肠绒毛的形态从手指状变为扁平状,但是莱芜猪的肠绒毛形态变化要小些(图1)。两品种仔猪断奶后隐窝深度都增加,但是空肠的变化差异不显著(P>0.05)(表2)。

本研究消化酶活性和肠道组织结构变化两方面,对比研究了莱芜猪和杜长大仔猪断奶应激的差异。地方品种莱芜猪在生产上表现为抗断奶应激能力比较强,通过指标的测定发现莱芜猪比杜长大有更高的消化酶活性,并且断奶后肠道组织损伤较轻,能够很快恢复,表明莱芜猪比杜长大有更强的抗断奶应激能力。

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