下喷式液泵型生物反应器与通用发酵罐KLa对比及应用

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(1.临安区环境监测站,浙江 杭州 311300；2.浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江 杭州 310014)

国外的液泵型生物反应器(Loop reactor)，因其产生的动力，即液泵置于生物反应器外部，输送液体的泵通过管道与反应器(或称发酵罐)连接，使反应器内的液体(料液)与器外的管道形成一个环流，而空气通过另一路管道通入反应器中，使液体和空气充分混合.这种液泵型生物反应器属外循环反应器，其优点是结构简单，传热、传质速率快[1-4]，但它最大的缺点是泵暴露在反应器外面，无法进行密封无菌操作，因此很容易染菌.近10 年来，浙江工业大学和镇江东方生物工程设备有限公司合作研制出了内循环下喷式液泵型生物反应器，即将耐热泵置于反应器内，反应器中还设计了射流阀和导流筒，以下喷式形式射向罐底，射流阀喷出的流体从罐底返回时液体从导流筒的中间与外边分别翻起，加剧了液体的湍动，增加了液体的溶解氧，有利于工业微生物的生长和繁殖.笔者测试了20 L下喷式液泵型生物反应器在不同通风比(0.462，0.615，0.846)和不同循环液速(2.71，2.38，2.01，1.64 L/min)下容积氧传递系数KLa的变化规律，并与3 L搅拌式生物反应器(即通用发酵罐)BioFlo110作对比试验.笔者试验了β-葡聚糖酶产生菌黑曲霉315在该反应器内的发酵代谢情况，并与3 L搅拌式生物反应器BioFlo110作对比.

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

紫外/可见分光光度计751GD，上海市仪器分析一厂；下喷式液泵型20 L生物反应器，镇江东方生物工程设备公司； 3 L搅拌式反应器BioFlo 110，New Brunwick Scientific；HYG-A回转恒温调速摇瓶柜，江苏太仓市实验设备厂.

1.2 方 法

1.2.1 亚硫酸钠氧化法测定溶氧传质系数KLa

1) 亚硫酸钠氧化法

溶氧传质系数KLa的测定方法采用亚硫酸钠氧化法[5].

2) 溶氧传质性能的对比方法

在相同的操作压力(0.1 MPa)和操作温度(25 ℃)下，利用亚硫酸钠氧化法分别测定两个反应器在不同的通风比和不同转速(液泵型反应器对应为循环液速)下的容积氧传递系数的大小，并初步选择通风比和转速，使两反应器容积氧传递系数大小相近.然后在转速和其他条件不变的情况下，只改变通风比，测定两反应器容积氧传递系数；同时在通风比和其他条件不变的情况下，只改变转速，测定两反应器容积氧传递系数； 根据所测容积氧传递系数，必能找出一组条件，使两反应器的容积氧传递系数相近，以此作为两反应器发酵性能对比的依据.

1.2.2 菌种与培养基

1) 菌 种

黑曲霉315(A.Niger315)由实验室提供.

2) 培养基

发酵培养基：玉米粉10 g/L，小麦粉10 g/L，豆饼粉30 g/L.

3) 酶活的测定

β-葡聚糖酶标准曲线的制作参考文献[6].β-葡聚糖酶活力测定方法：以大麦β-葡聚糖为底物，采用DNS光电比色法测定.酶活单位定义：以β-葡聚糖为底物，采用DNS显色，光电比色法，在pH=7.0，温度40 ℃条件下，1 min使底物产生1 μg葡萄糖所需的量，定义为一个单位(U).β-葡聚糖酶活力单位(U/mL)=r×Df/t，其中：r为与标准葡萄糖溶液相对应的质量浓度(μg/mL)；Df为待测酶液的稀释倍数；t为反应时间(5 min).

样品测定：待测酶液用蒸馏水稀释适当倍数，取经40 ℃预热的质量分数为1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL，混匀，再加入3 mL DNS试剂，然后沸水加热5 min，待冷却至室温后测定OD值.

空白制作：取蒸馏水1 mL，先加入DNS试剂3.0 mL，加入质量分数为1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL，再加入水加热5 min，待冷却后，测定OD值.

2 结果与讨论

2.1 两反应器容积氧传递系数的对比试验

2.1.1 液泵型反应器容积氧传递系数变化规律的测试

表120L下喷式液泵型生物反应器容积氧传递系数变化规律测试实验

Table1TransfomationregulationofKLain20LJLRreactor

序列号通风比vvm/(L·L-1·min-1)液泵转速/(r·min-1)KLa/h-110．462∶180058．420．462∶1100076．130．462∶1120095．240．462∶11400111．450．615∶11200109．560．846∶11200120．970．615∶11400148．580．846∶11400173．3

当通风比一定时(0.462∶1)，液泵型反应器的容积氧传递系数KLa随着液泵转速的增大而明显增大，且有一定的线性关系.该反应器的液泵转速对应着液喷速度的大小，当通风比一定时，增大液喷速度有利于减小气泡直径和气体在水里的分散，从而容积氧传递系数明显增大.通风比一定时(0.462∶1)，KLa与液泵转速的关系曲线线性度较高，这可能是由于在低通风比(且通风比一定)时，容积氧传递系数与液喷速度几乎成正比关系，也就是容积氧传递系数KLa与气、液喷速度的关联式中，液喷速度的指数接近于1.

当液泵转速一定时，该反应器的容积氧传递系数KLa随着通风比的增大而增大，但无线性关系.这是因为增大通风比有利于增大持气率和扩大气液界面面积，而增大持气率和扩大气液界面面积均有利于提高容积氧传递系数KLa.当液泵转速为1 200 r/min时，容积氧传递系数KLa随着通风比的变化不如液泵转速为1 400 r/min时显著，这说明在低液喷速度时，通风比的变化对容积氧传递系数KLa的影响不显著，此时液喷速度是瓶颈.

2.1.2 液泵型反应器的液泵转速与循环液速之间的关系

用自来水将反应器注满，即在反应器内装入20 L水，调节并设置液泵转速为800 r/min，待显示屏的转速读数稳定在800 r/min时，再往反应器内加水，直至加满，准备好秒表，在打开排料阀门的同时按下秒表开始记时，当反应器内水排完的瞬间按一下秒表，结束记时.照此，改变转速为1 000，1 200，1 400，1600 r/min，进行重复试验，结果见表2.

表220L下喷式液泵型生物反应器液泵转速与循环液速关系

Table2Relationshipbetweenpump’sagitationandliguidcircularratein20LJLPreactor

序列号液泵转速/(r·min-1)循环周期/min循环液速/(L·min-1)平均循环液速/(L·min-1)6．503．0818006．433．113．096．483．087．402．70210007．352．722．717．362．718．412．38312008．482．363．388．342．399．962．014140010．051．992．019．812．0412．181．645160012．241．631．6412．201．65

表2反映了液泵转速与循环液速之间的关系，每一个液泵转速必对应着一个循环液速，即两者有一一对应关系，一般来说液泵转速大，相应的循环液速也较大.

2.1.3 搅拌式生物反应器容积氧传递系数变化规律的测试

表3搅拌式生物反应器容积氧传递系数变化规律测试实验表

Table3TransfomationregulationofKLainagitationreactor

序列号通风比vvm/(L·L-1·min-1)搅拌转速/(r·min-1)KLa/h-111∶120042．1021∶130051．3031∶140094．4341∶1500157．0551∶1600282．7361．25∶1500162．1071．5∶1500173．20

由表3可知：搅拌式反应器容积氧传递系数KLa随着通风比、搅拌转速的变化而变化，且随它们的增大而增大.当搅拌转速一定时，搅拌式反应器容积氧传递系数KLa随着通风比的增大而增大，但这一变化不是很显著.这有可能是在较高的搅拌转速下，影响容积氧传递系数KLa的主要因素不再是通风量，也就是通风量对容积氧传递系数KLa的贡献不大.当通风比一定时，增大搅拌转速有利于提高容积氧传递系数KLa.但也不难发现低转速区，增大搅拌转速对容积氧传递系数KLa的提高不如高转速区显著.这说明在低转速区，影响容积氧传递系数KLa的主要因素不是搅拌转速，通风量的影响可能起重要作用.

2.1.4 液泵型生物反应器与搅拌式生物反应器的对比

由液泵型反应器的容积氧传递系数变化规律可知：在温度和压力等操作条件一定时，影响液泵型反应器容积氧传递系数KLa的主要因素是液泵转速和通风比.当通风比一定时容积氧传递系数随液泵转速的变化几乎成线性关系；而当液泵转速一定时，容积氧传递系数随通风比的增大而增大，但这一变化的程度取决于液泵转速的大小，在高液泵转速下，这一变化较显著.

由搅拌式生物反应器容积氧传递系数变化规律可知：在温度和压力等操作条件一定时，影响搅拌式生物反应器容积氧传递系数KLa的主要因素是搅拌转速和通风比.当通风比一定时，增大搅拌转速有利于提高容积氧传递系数KLa，这一变化在高搅拌转速区比在低搅拌转速区显著.当搅拌转速(较高)一定时，增大通风比有利于提高容积氧传递系数KLa，但这一变化并不显著.

搅拌转速为500 r/min、通风比为1.5∶1的3 L搅拌式生物反应器BioFlo110与液泵转速为1 400 r/min、通风比为0.846∶1的20 L下喷式液泵型生物反应器具有几乎相同的容积氧传递系数KLa(173.2 h-1).在试验的系列范围内，改变20 L下喷式液泵型生物反应器的通风比和液泵转速为适当值时，能找到一组操作变量(通风比和液泵转速)使其容积氧传递系数KLa与3 L搅拌式生物反应器BioFlo110的容积氧传递系数KLa相等，这为后述实罐发酵对比奠定基础.

2.2 两反应器用于黑曲霉315生产β-葡聚糖酶的发酵性能对比

2.2.1 发酵过程基本操作

根据1.2.2节2)中列出的黑曲霉315生产β-葡聚糖酶的发酵培养基配方要求，分别配制13，1.75 L培养基基质，加自来水分别稀释培养基至9，1.75 L(对于20 L反应器事先进行一次空消，计算出冷却水体积为4 L)，然后分别进行一次实罐灭菌操作，待培养基冷却后，按5%的接种量分别向两反应器接入经扩培后的黑曲霉315种子液(注意无菌操作的规范性和严谨性).以两反应器容积氧传递系数变化规律的对比试验得出的使两反应器的容积氧传递系数相近的一组通风比、转速条件作为本次发酵的通风比、转速的条件(液泵型生物反应器的液泵转速为1 400 r/min、通风比为0.846∶1；搅拌式生物反应器的搅拌转速为500 r/min、通风比为1.5∶1，而且一直保持到发酵结束为止.调节两反应器的温度控制系统，控制发酵温度在30 ℃，调节20 L反应器的进出口阀门，控制反应器内的表压为0.05 MPa，待两反应器基本参数稳定后，开始取样，开始两次隔8 h取一次样，估计16 h以后酶活开始上升，所以以后每隔2 h取一个样，并尽快对所取的样品进行β-葡聚糖酶酶活的测定.

2.2.2 两反应器中β-葡聚糖酶产生菌株发酵结果

两发酵罐发酵产酶代谢曲线见图1，2.由图1，2可知：液泵型生物反应器发酵黑曲霉所得的β-葡聚糖酶的酶活优于搅拌式反应器，而且高峰期提前6 h，并且上升速率(从开始上升到到达高峰的速度)也较快.分析其原因有以下几点：1) 黑曲霉为严格的好养菌，在其生长高峰期对氧的需求量特别大，液泵型生物反应器利用高速液体射流的动能是其在反应器中均匀分散、悬浮，继而在反应器内形成整体的环流，使各相密切接触，很好地保证了此时黑曲霉对氧的需求；2) 黑曲霉为丝状真菌，搅拌式反应器的搅拌装置对黑曲霉有较大的剪切力损伤，影响了黑曲霉的生长，导致了酶活的降低，而液泵型生物反应器对黑曲霉的剪切力损伤较小，黑曲霉可以正常生长，所以所得的β-葡聚糖酶的酶活也相对较高.

图1 20 L下喷式液泵型生物反应器中酶活变化曲线Fig.1 Time curve of enzymatic activity in 20 L reversed jet loop reactor

图2 3 L搅拌式生物反应器中中酶活变化曲线Fig.2 Time curve of enzymatic activity in 3L universal fermenter

3 结 论

20 L下喷式液泵型生物反应器的容积氧传递系数KLa随通风比、液泵转速的提高而增大，且当通风比一定时，KLa与液泵转速的关系曲线线性度较高，当液泵转速一定时，低液喷速度时通风比的变化对容积氧传递系数KLa的影响不如高液喷速度时显著.3 L搅拌式生物反应器BioFlo110容积氧传递系数KLa随着通风比、搅拌转速的增大而增大，且低搅拌转速区时，增大搅拌转速对容积氧传递系数KLa的提高不如高转速区时显著.通过实验，找到使两反应器的KLa相等的一组操作条件，并为发

酵条件的控制奠定基础.通过黑曲霉315在两反应器内的发酵性能对比，发现在使两反应器KLa相等的那组操作条件下，两反应器的氧传速率存在差别，且两反应器的内部构造存在较大差别，这导致细胞在反应器内生长环境的显著不同，实验发现液泵型反应器适合黑曲霉等微生物的发酵代谢，得到的发酵结果相对较好，且发酵时间缩短了6 h，大幅度节省了能耗.

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