基于主成分分析和聚类分析的火龙果酵素抗氧化功能评价

， ，，

(1.杭州医学院，浙江 杭州 310053；2.绍兴文理学院 元培学院，浙江 绍兴 312000；3.浙江科技学院 生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023；4.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023；5.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江 杭州 310023)

食用植物酵素(Edible Plant Jiaosu)[1-6]是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类、菌菇类等食材为原料，加(或不加)糖类物质，在较低温度下，经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品，拥有丰富的代谢产物功能成分、植物本身营养成分和益生菌本身功能成分等，特别是富有小分子功能成分.研究表明：该类产品具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能.

火龙果营养丰富，富含多酚、黄酮、维生素、膳食纤维、蛋白质和各种微量元素等，还含有一般水果少有的植物性白蛋白和特有的花青素成分，属于高维生素、低糖、低脂的“一高两低”功能食品[7].目前，针对火龙果酵素的研究报道极少，已有的研究报道主要集中在火龙果酵素产品的抗氧化活性和原花青素的测定方面[8-9].笔者跟踪检测了火龙果酵素发酵过程中pH值、总多酚含量变化以及抗氧化活性等指标的变化，并对不同发酵时间的各项指标进行相关性分析、主成分分析和聚类分析，旨在为火龙果酵素的发酵和产业化开发提供科学指导和理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红心火龙果，浙江省嘉兴市桐乡殷家漾村漾漾红果业专业合作社；白糖，太古优级白砂糖；酵液，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室自制.

没食子酸、磷酸二氢钾、ABTS、三氯乙酸、铁氰化钾和三氯化铁等(以上均为分析纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚(分析纯)，上海长哲生物科技有限公司；过硫酸钾(分析纯)，西陇化工股份有限公司.

1.2 仪器设备

XW-80A型微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；PHS-3C型精密酸度计，杭州齐威仪器有限公司；Allegra X-12R型冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度计，上海市元析仪器有限公司；PTX-FA210型电子天平，福州华志科学仪器有限公司.

1. 3 方 法

1.3.1 火龙果酵素制备

摘取无腐烂的新鲜火龙果，清洗，干燥脱去表面水分，切块后按照质量比1∶1的比例与白砂糖混合，加入适量酵素菌液，密封，15～25 ℃条件下进行发酵，适当时间进行放气、搅拌、观测.取样时，开启发酵罐搅拌装置进行充分混合，然后取样，样品经10 000 r/min离心10 min后取上清液用于测定.

1.3.2 发酵过程中总多酚含量变化

参照GB/T 31740.2——2015茶多酚[10]的检测方法，以没食子酸为标品，绘制标准曲线.

1.3.3 发酵过程中抗氧化能力变化

1) ABTS自由基清除能力.参照Nikolaos[11]的方法，略作改动.称取6.62 mg过硫酸钾和38.41 mg ABTS，用PBS(5 mmol/L，pH为7.4)定容至10 mL，室温下黑暗处反应12～16 h，使用前用上述PBS缓冲液适当稀释，使其在734 nm下吸光度为0.70±0.02.取10 μL样品，加入PBS缓冲溶液至300 μL，加入上述稀释液5 mL，混匀，30 ℃下反应1 h.以去离子水为参比溶液，于734 nm下测定吸光度.ABTS自由基清除能力的计算公式为

式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度.

2) 还原力.取140 μL样品，加磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)至5 mL，与5 mL 1 g/L的铁氰化钾混合均匀后，50 ℃下反应30 min，加入5 mL10 g/L的三氯乙酸，混合均匀，静置10 min，取5 mL上清液，与5 mL去离子水和1 mL 0.1 g/L的三氯化铁充分混合，以去离子水为参比溶液，在700 nm下测定[12-13].

1.3.4 发酵过程中pH变化

发酵过程中pH利用pH计进行测定.

1.3.5 数据处理

实验数据采用SPSS 18.0统计软件，对火龙果酵素发酵过程中总多酚含量、pH变化、ABTS自由基清除能力和还原力等各项指标进行相关分析、主成分分析(Principal component analysis)和系统聚类分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)，P<0.05[14].

2 结果与分析

2.1 发酵过程中总多酚含量变化

以方程y=0.0 097x+0.019，R2=0.9 996为标准曲线，计算火龙果酵素发酵过程中17 个时间点总多酚含量，方程中：y代表吸光度，x代表没食子酸等价物(μg/mL).火龙果酵素发酵过程中总多酚含量的变化见图1，从图1可以看出：发酵过程中火龙果酵素发酵液中总多酚的含量整体上呈增加的趋势，发酵487 d，从发酵初始的360.14 μg/mL增加至486.25 μg/mL，增加了35.02%.

图1 火龙果酵素发酵过程中总多酚含量变化Fig.1 Changes of total polyphenols content in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.2 发酵过程中抗氧化能力变化

2.2.1 发酵过程中ABTS自由基清除能力变化

ABTS自由基清除能力实验中常用ABTS与过硫酸钾反应生成ABTS·+，ABTS·+可以溶于水溶液和有机溶液，可以用来测定水溶性可脂溶性抗氧化物的抗氧化能力[15].火龙果酵素发酵过程中发酵液对ABTS自由基清除能力的变化见图2，从图2可以看出：随着发酵时间的延长，火龙果酵素发酵液对ABTS自由基清除能力呈明显增加的趋势，经487 d的发酵，清除能力从发酵初期的25.37%增加至47.43%，增加了86.95%.研究表明：大部分的天然抗氧化物是酚类物质[14]，火龙果中富含原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和丁香酸等多酚类物质[16]，发酵过程中，发酵液的ABTS自由基清除能力的增强可能与发酵液中多酚含量的变化有关.

图2 火龙果酵素发酵过程中ABTS自由基清除能力变化Fig.2 Changes of ABTS radical scavenging ability in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.2.2 发酵过程中还原力变化

还原力的测定主要是基于电子的转移方法，抗氧化物通过转移电子使Fe3+被还原，再向反应液中加入FeCl3，生成的蓝色物质在700 nm处有最大吸收，通过测定吸光度来评价还原力的大小.吸光度高反应抗氧化物的还原力强[15].火龙果酵素发酵过程中还原力的变化见图3，从图3可以看出：火龙果酵素发酵过程中还原力变化较慢，经487 d发酵，吸光度从发酵初期的0.373增加到0.488，增加了30.83%，说明发酵过程中还原力增强.

图3 火龙果酵素发酵过程中还原力变化Fig.3 Changes of reducing power in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.3 发酵过程中pH变化

火龙果酵素发酵过程中pH的变化见图4，由图4可知：火龙果酵素发酵过程中，发酵初期pH值最高，为4.28，随着发酵时间的延长，pH值逐渐降低，发酵至255～295 d，pH值最低，为3.94，随着发酵时间的延长，发酵至300 d后，pH值又缓慢升高，发酵至393～487 d，pH值稳定在4.08左右.发酵过程中pH的变化可能与发酵过程中酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等菌种代谢生成乳酸[17]、醋酸和琥珀酸酸性物质有关.

图4 火龙果酵素发酵过程中pH变化Fig.4 Changes of pH in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.4 统计分析

2.4.1 火龙果酵素发酵过程中发酵液各指标间相关性分析

采用SPSS 18.0软件对火龙果酵素发酵过程中抗氧化能力(ABTS自由基清除能力和还原力)、总多酚和pH等评价指标之间的相关性进行分析，结果见表1.

表1各项指标的相关性分析

Table1Correlationcoefficientsof4indices

TPC1)ABTS2)RP3)pHTPC1．0000．7784)0．9294)-0．077ABTS1．0000．8654)-0．578RP1．000-0．146pH1．000

注：1) TPC为总多酚含量；2) ABTS为ABTS自由基清除能力；3) RP为还原力；4) 表示p<0.001.

从表1中可以看出：火龙果酵素发酵过程中，总多酚与ABTS自由基清除能力和还原力之间具有极显著的正相关性(p<0.001)；ABTS自由基清除能力与还原力之间呈极显著的正相关性(p<0.001)，而总多酚、ABTS自由基清除能力、还原力与pH之间存在负相关性.由各个指标之间的相关性分析可知，部分指标间存在着信息重叠，有必要对其进行进一步简化以明确主要的综合指标.

2.4.2 主成分分析

由各指标相关性分析可知：火龙果酵素发酵过程中总多酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力及pH 4 个抗氧化评价指标间存在着相互重叠和相互干扰的状态，因此需要选择彼此不相关的新指标来代替原来有相关性的指标，消除多重共线性，以达到综合评价的目的.将17 个不同时间点的火龙果酵素发酵液的总多酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力和pH值等4 个参数依次输入SPSS软件进行主成分分析，为了克服各个不同量纲变量的影响，先对各变量进行标准化处理，经标准化处理后，再对各指标进行主成分分析，主成分的特征值见表2，各成分特征值的碎石图见图5.

表2主成分的特征值、贡献率和累计贡献率

Table2Theeigenvalue,contributionrateandthecumulativecontributionrateofprincipalcomponents

主成分特征值贡献率/%累积贡献率/%12．83370．82270．82221．06026．48997．31030．0862．14199．45240．0220．548100．000

图5 碎石图Fig.5 Scree plot

表2中给出了主成分的特征值，前两个特征值均大于1，且前两个主成分累积方差贡献率达到原始信息的97.31%.从图5可以看出：前两个主成分的斜率陡峭，第三个主成分的斜率变缓，因此可以确定主成分的个数为2，使用这些成分在很大程度上减少了原始数据指标的复杂性，仅丢失了2.69%的信息.第一主成分主要综合了总多酚含量、ABTS自由基清除能力和还原力3 个评价指标，且3 个评价指标间具有正相关性；第二主成分主要综合了pH指标，且与其他3 个指标间具有负相关性；与上述相关性分析结果相一致.利用2 个新变量来代替原来的4 个变量，新的变量分别用PC1，PC2表示，4 个指标总多酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力及pH经标准化处理后的变量分别以ZTPC，ZABTS，ZRP和ZpH表示，它们之间的线性关系为

PC1=0.573×ZTPC+0.564×ZABTS+0.540×ZRP-0.248×ZpH

PC2=-0.203×ZTPC+0.201×ZABTS+0.343×ZRP+0.878×ZpH

2.4.3 综合评价

以每个主成分所对应的特征值占所提取主成分总特征值之和的比例作为权重，经线性加权求和得到综合评价指标(Comprehensive evaluation index，CEI)为

不同发酵时间点的火龙果酵素抗氧化评价指标结果见表3和图6.

表3抗氧化综合评价指标

Table3Comprehensiveevaluationindexofantioxidantcapacity

编号发酵时间/dPC1PC2综合得分120-2．5950．784-1．675241-1．2480．721-0．712362-1．7050．764-1．0334102-1．2270．450-0．7705114-0．6260．538-0．3096137-1．6350．430-1．0737156-0．4110．306-0．21681740．0710．1960．1059214-0．960-1．054-0．98610235-0．670-1．295-0．84111255-0．484-1．608-0．790122750．093-1．360-0．303133592．5370．3921．953143931．3520．0581．000154261．8600．3791．457164562．8090．2372．109174872．8380．0622．082

图6 抗氧化综合评价指标Fig.6 Comprehensive evaluation index of antioxidant capacity

从图6可以看出：发酵至456 d以后，综合评价指标达到最高值且趋于稳定，说明在此时间范围内火龙果酵素的抗氧化能力较优.

2.4.4 聚类分析

对火龙果酵素发酵过程中各指标进行因子分析，经旋转后因子载荷矩阵见表4.首先利用主成分法提取因子，再利用Varimax最大方差法旋转，经3 次迭代收敛，从旋转后的因子与原始变量的相关矩阵可以看出，第一主成分与3 个变量的相关较高，这3 个变量是ABTS自由基清除能力、还原力和总多酚的含量，第二主成分与pH的相关性更高.第一个因子主要概括了火龙果酵素发酵液中抗氧化成分及抗氧化能力情况，可以命名为抗氧化因子，第二因子是火龙果酵素发酵的环境，可以命名为环境因子.

表4 旋转后因子载荷矩阵1)

注：1) 提取方法为主成分分析法；旋转方法为方差最大正交旋转.

进一步对不同发酵时间火龙果酵素的4 个评价指标进行聚类分析，采用类间平均链锁法(Between groups linkage)，依据综合评价指标间的欧氏距离的平方进行聚类.聚类分析结果见图7，图7中编号对应的发酵时间见表3.

从图7中可以看出：系统树状图直观的显示了聚类的整个过程，而且x轴方向给出了各类别之间的相对距离大小.在类间距离为10时，17 个不同发酵时间的火龙果酵素样品可以分为3 类，聚为3 类，因子的分散点图见图8，从图8可以看出：第一类聚集了1～8 个时间点，即20～174 d，聚集了发酵过程中总多酚、pH、ABTS自由基清除能力和还原力变化较明显的阶段，这个阶段，火龙果酵素的抗氧化能力相对较低，发酵液的pH较高；第二类聚集了9～12 个时间点，即214～275 d，聚集了发酵过程中总多酚、pH和还原力变化较平缓的阶段，这个阶段，火龙果酵素的抗氧化能力、发酵液的pH相对较低；第三类聚集了13～17 个时间点，即359～487 d，聚集了发酵过程中火龙果酵素的抗氧化能力、发酵液的pH相对较高，此阶段，火龙果酵素的抗氧化能力呈缓慢增加的趋势，延长发酵时间有利于提升火龙果酵素的抗氧化能力.

图7 聚类分析系统树状图Fig.7 Hierarchical dendrogram

图8 因子得分散点图Fig.8 Scatter plot of factor score

3 结 论

对火龙果酵素发酵过程中发酵液的总多酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力和pH值进行跟踪检测，并采用相关分析、主成分分析和聚类分析，探讨发酵时间对火龙果酵素抗氧化功能的影响，结果表明：随着发酵时间的延长，发酵液中总多酚含量、ABTS自由基清除能力和还原力整体上呈增加的趋势，火龙果酵素发酵液的pH呈缓慢降低的趋势，从4.28降到4.08.董银卯等[8]研究表明：火龙果酵素具有清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟基自由基的能力以及抗氧化活性；蒋增良等[2]对树莓等酵素中总多酚含量与ABTS自由基清除实验、还原力测定等体外抗氧化评价指标间的相关性进行分析，结果表明：总多酚的含量与ABTS自由基清除实验、还原力等显著正相关.火龙果酵素发酵过程中，不同时间点发酵液的总多酚含量与ABTS自由基清除能力、还原力的分析结果显示：火龙果酵素中总多酚含量与ABTS自由基清除能力、还原力呈极显著的相关性.通过主成分分析和聚类分析对火龙果酵素的抗氧化功能进行评价，主成分分析结果表明：可以从总多酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力和pH等4 个指标中提取出2 个主成分，第一主成分/因子主要与总酚含量、ABTS清除率和还原力相关；第二主成分主要与pH相关；发酵至456 d以后，综合评价指标达到最高值且趋于稳定，说明在此时间范围内火龙果酵素的品质达优.聚类分析结果表明：在类间距离为10时，聚类分析可将发酵过程分为3 类，即因子显著变化期、平缓期和缓慢增长期.

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