烯酰吗啉对土壤呼吸及微生物多样性的影响

周东兴，邓 杰，李 晶，邬欣慧，荣国华，苏 叶，斯琴毕力格

(东北农业大学 资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨150030)

棚室作为特殊的生态系统，与露地栽培有较大差别，为病虫生物提供了适宜的环境条件，使病虫生物得以大量滋生，另外害虫和病原菌易产生抗药性，导致农药高频、高剂量的使用[1-2]。前人研究结果表明，烯酰吗啉的施用会导致葡萄霜霉病菌抗药性急剧增强[3-4]。此外，由于棚室特殊的生态环境，导致烯酰吗啉在设施作物和土壤中的持久性均远高于露地环境[5]。烯酰吗啉作为一种内吸型低毒杀菌剂，应用范围广泛，易通过吸附、沉降等作用进入土壤环境并在土壤中残留，进而对土壤环境产生影响。由于频繁施用，导致土壤中烯酰吗啉含量逐渐积累，朴秀英等[6]发现烯酰吗啉在吉林黑土中的降解半周期为69 d，属于中等至难降解农药。

土壤微生物学指标在一定程度上反映了土壤的基本状况[7-9]，是评价土壤环境质量的重要指标之一[10-11]，也是反映土壤生态系统的胁迫程度和生态系统对污染承受力的重要依据[12-13]。孔凡彬等[14]研究证实，烯酰吗啉对土壤呼吸强度有一定的抑制作用。但是目前关于烯酰吗啉对土壤微生物多样性影响的研究较少。本研究探讨了烯酰吗啉对土壤呼吸强度以及土壤微生物多样性的影响，以期为烯酰吗啉的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试土壤采自东北农业大学园艺试验站(无杀菌剂)。取耕作层(0～20 cm)土壤，采样前先去除土壤表面的杂物，过孔径2 mm土壤筛备用。土壤基本理化性质如下[15]：有机质含量46.5 g/kg，总氮含量1.10 g/kg，速效磷含量14.75 mg/kg，速效钾含量101.00 mg/kg，含水量26%，pH 6.93。

供试药剂：商品烯酰吗啉(有效成分为69%，可湿性粉剂)购自山西运城金大地农贸有限公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 试验设计

称取2 kg供试土壤，在土壤中施用不同含量的烯酰吗啉水溶液，使土壤中烯酰吗啉的初始含量分别为5，10和25 mg/kg，以不施用烯酰吗啉处理作为空白组(CK)，每次处理3个重复。将药剂均匀喷洒在土壤表面，每隔15 d重复喷施1次，共进行3次施用处理。调节土壤含水量至土壤持水量的60%，保持其含水量恒定，置于(28±1) ℃的条件下培养60 d，施用处理后的45～60 d为试验恢复期。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤呼吸强度 于每次施用烯酰吗啉后的7，14 d以及培养60 d，采用CO2直接吸收法[15]进行土壤呼吸强度测定。

1.3.2 土壤微生物群落多样性 一般采用BIOLOG ECO法[16]分析土壤微生物多样性(用McIntosh指数、Shannon物种丰富度指数、Simpson优势度指数表征)时，选择的温育时间分别为96，120，144和168 h[17]。故本研究选择以上温育时间进行分析。

1)McIntosh指数(U)[18]。其计算公式为：

式中：ni是第i孔的相对吸光值，Ci为第i孔在590 nm的吸光值，R为对照孔在590 nm的吸光值。

2)Simpson优势度指数(D)[19]。其计算公式为：

式中：ni是第i孔的相对吸光值，N是相对吸光值总和，Ci为第i孔在590 nm的吸光值，R为对照孔在590 nm的吸光值。

3)Shannon 物种丰富度指数(H)[20]。其计算公式为：

H=-∑pilnpi。

式中：pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。

1.3.3 土壤碳源利用情况 每次施用处理第1 天采集土样，于(28±1) ℃的条件下分别培养24，48，72，96，120，144和168 h后，采用BIOLOG ECO法[16]测定土壤总碳源利用率(AWCD)。土壤微生物能利用31种碳源，而31种碳源分为六大类，分别为碳水化合物(β-甲基D-葡萄糖苷、D-木糖、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-葡萄胺酸、葡萄糖-1-磷酸盐、D,L-a-甘油、D-纤维二糖、a-D-乳糖、D-半乳糖内酯、D-半乳糖醛酸)、氨基酸(L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸)、多聚物(吐温40、吐温80、a-环式糊精、肝糖)、酚酸(2-羟苯甲酸、4-羟基苯甲酸)、羧酸(丙酮酸甲脂、y-羟基丁酸、衣康酸、a-丁酮酸、D-苹果酸)以及胺类(苯乙基胺、腐胺)，故本研究分析了土壤微生物对不同种类碳源利用情况，结果以不同种类碳源利用率占AWCD的比例表示[21-22]。参照董立国等[23]的研究可知温育96 h时碳源利用率变化幅度最大，故选取温育96 h时不同种类碳源利用率进行分析。此外，为探讨不同含量烯酰吗啉对31种碳源利用情况的影响，本研究采用SPSS 19.0对烯酰吗啉施用3次后土壤温育96 h的31类碳源利用率进行主成分分析(PCA)。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2013进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同含量烯酰吗啉对土壤呼吸强度的影响

图1表明，随着施用时间的延长，与CK相比，烯酰吗啉对土壤呼吸总体有明显的抑制作用。施用7 d，当烯酰吗啉含量为5 mg/kg时，土壤呼吸强度略有提高，但与CK相比，差异不显著；当烯酰吗啉含量为10，25 mg/kg时，土壤呼吸强度显著降低。施用14 d，与CK相比，烯酰吗啉处理土壤呼吸强度显著降低，且各处理间差异显著。施用22 d，与CK相比，5，10 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度显著增强，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的呼吸强度显著降低。施用29～44 d后，与CK相比，5～25 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度均显著降低，其中25 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度降幅最大。施用60 d，与CK相比，5～25 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度均显著降低；与施用29～44 d后相比，5 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度未见恢复，10～25 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤呼吸强度略有恢复。

图柱上标不同小写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)。图2同 Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05).The same for Fig.2

2.2 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落多样性指数的影响

2.2.1 Shannon物种丰富度指数 Shannon物种丰富度指数越大，表明土壤微生物对碳源的利用越多，利用强度越大。由于温育168 h与144 h时不同含量烯酰吗啉处理下土壤微生物群落Shannon物种丰富度指数的变化规律相同，故温育168 h的结果未列出。由图2可知，温育96 h，第1次和第2次施用处理后，与CK相比，5，10 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数无显著变化，而25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数均显著降低，表明烯酰吗啉对土壤Shannon物种丰富度有显著的抑制作用；第3次施用处理后，与CK相比，各烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数均大幅度下降，且差异显著。温育120 h，第1次和第2次施用处理后，与CK相比，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数均无显著变化；但第3次施用处理后，与CK相比，5 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数无显著变化，而10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数均显著降低。温育144 h，与CK相比，各烯酰吗啉处理土壤的Shannon物种丰富度指数无显著变化。整体而言，Shannon物种丰富度指数受烯酰吗啉影响不大，表明烯酰吗啉对土壤微生物群落丰富度影响较小。

图2 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落Shannon物种丰富度指数的影响Fig.2 Effects of different dimethomorph concentrations on Shannon species richness index

2.2.2 Simpson优势度指数 由表1可知，在同一施用次数和温育时间下，随着烯酰吗啉含量的增加，土壤的Simpson优势度指数呈先增加后降低的趋势。第1次施用处理后，在同一温育时间下，与CK相比，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤对Simpson优势度指数无显著影响。第2次施用处理后，在同一温育时间下，与CK相比，5，10 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数无显著变化；25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数在温育96 h无显著变化，但在温育120，144 和168 h时显著降低。第3次施用处理后，在同一温育时间下，与CK相比，5 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数无显著变化,10 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数在温育144和168 h显著降低，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数在温育120，144，168 h时显著降低。在第1次和第2次施用处理后，随着温育时间的延长，各烯酰吗啉处理土壤的Simpson优势度指数无明显的变化规律；但是在第3次施用处理后，随着温育时间的延长，除CK和5 mg/kg烯酰吗啉处理外，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数总体降低。随着施用次数的增加，CK和5 mg/kg烯酰吗啉处理土壤Simpson优势度指数变化不明显，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤在温育120，144，168 h时Simpson优势度指数总体降低。

表1 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落Simpson优势度指数的影响Table 1 Effects of different dimethomorph concentrations on Simpson dominance index

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same for table 2.

2.2.3 McIntosh指数 一般能被利用的碳源种类越多，某些优势明显(碳源利用强度大)的微生物物种群落McIntosh指数值越大，常用来衡量群落均一性程度[24]。由表2可知，第1、2次施用后，与CK相比，5，10 mg/kg烯酰吗啉处理McIntosh指数总体无显著变化，25 mg/kg烯酰吗啉处理McIntosh指数总体显著降低；第3次施用后，与CK相比，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤McIntosh指数总体显著降低。第1、2次施用后，随着温育时间延长，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤McIntosh指数无明显变化规律；第3次施用后，随着温育时间延长，5，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤McIntosh指数逐渐增大，而10 mg/kg烯酰吗啉处理土壤McIntosh指数呈先增大后减小趋势。说明烯酰吗啉的多次施用对土壤均一度产生不同程度的影响，但随着温育时间的延长，影响程度总体减弱。

表2 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落McIntosh指数的影响Table 2 Effects of different dimethomorph contents on McIntosh index

2.3 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落碳源利用的影响

2.3.1 对土壤微生物群落AWCD值的影响 AWCD值反映了土壤微生物的代谢活性[25]，是土壤微生物群落利用碳源的重要指标，其值越大，表明微生物对碳源的利用率越大。由表3可知，在第1次施用后，与CK相比，5，10 mg/kg烯酰吗啉处理的土壤AWCD值无显著变化，表明低含量烯酰吗啉污染对土壤AWCD值影响较小；25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤的AWCD值总体显著减小，表明高含量烯酰吗啉对土壤AWCD值影响明显，对土壤微生物的代谢活性有明显抑制作用。在第2次和第3次施用后，与CK相比，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理土壤AWCD值总体显著减小，表明随着施用次数的增加，烯酰吗啉对土壤AWCD值影响越明显，对土壤微生物代谢活性的抑制作用越强。在同一含量烯酰吗啉处理下，随着温育时间的延长，土壤的AWCD值总体呈增加的趋势，表明烯酰吗啉对土壤微生物代谢活性的抑制作用减弱。

表3 不同含量烯酰吗啉对土壤微生物群落AWCD值的影响Table 3 Effects of different dimethomorph contents on AWCD value

注：同行数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in same line indicate significant difference (P<0.05).

2.3.2 对6类碳源利用的影响 表4为高频施用烯酰吗啉在温育96 h时土壤微生物对6类碳源的利用情况。由表4可以看出，第1次施用处理后，当烯酰吗啉含量为5 mg/kg时，土壤微生物对各类碳源利用率差异较小，表明烯酰吗啉对土壤微生物多样性影响较小；当烯酰吗啉含量为10，25 mg/kg时，土壤微生物对羧酸利用率较其他碳源明显升高。第2次施用处理后，与烯酰吗啉含量为5 mg/kg相比，当烯酰吗啉含量为10，25 mg/kg时，土壤微生物对碳水化合物、氨基酸以及酚酸类碳源利用率均上升，而羧酸类碳源利用率均下降。第3次施用处理后，与第2次施用处理相比，5，10，25 mg/kg烯酰吗啉处理后，土壤微生物对碳水化合物利用率均明显增大，占AWCD的比例分别达到28.36%，28.09%，28.54%；土壤微生物对酚酸、羧酸、氨基酸类碳源利用率均降低，其中对酚酸类碳源利用率降低幅度更明显。在整个施用处理过程中，土壤微生物对多聚物和胺类碳源利用率的变化幅度总体较小。

表4 不同含量烯酰吗啉处理土壤温育96 h后微生物对6类碳源利用率占AWCD的比例 Table 4 The ratios of six carbon source utilization rates to AWCD 96 h after treatments with different dimethomorph concentrations %

2.3.3 对31种碳源利用的主成分分析 图3～5分别为5，10，25 mg/kg烯酰吗啉3次施入土壤后温育96 h微生物碳源利用情况的PCA结果。

X1～X31分别为丙酮酸甲脂、吐温40、吐温80、a-环式糊精、肝糖、D-纤维二糖、a-D-乳糖、β-甲基D-葡萄糖苷、D-木糖、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、 N-乙酰基-D-葡萄胺、D-葡萄胺酸、葡萄糖-1-磷酸盐、D,L-a-甘油、D-半乳糖内酯、D-半乳糖醛酸、2-羟苯甲酸、4-羟基苯甲酸、y-羟基丁酸、 衣康酸、a-丁酮酸、D-苹果酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、苯乙基胺、腐胺。下图同 X1-X31：Pyruvic acid methyl ester，Tween 40，Tween 80，a-cyclodextrin，Glycogen，D-Cellobiose，a-D-lactose，β-methyl-D-glucoside,D-xylose，I-erythritol，D-mannitol，N-acetyl-D-glucosamine，D-galactonic acidy-lactone，Glucose-1-phosphate,D,L-a-aglycerol phosphate,D-galacturonic acid，D-galacturonic acid,2-hydroxy benzoic acid，4-hydroxy benzoic acid，y-hydroxybutyric acid，Itaconic acid,a-ketobutyric acid,D-malic acid,L-arginine，L-asparagine，L-phenylalanine，L-serine，L-threonine,Glycyl-L-glutamic acid，Phenylethyl-amine，Putrescine.The same below

图4 10 mg/kg烯酰吗啉施用3次处理土壤温育96 h的微生物碳源利用PCA结果Fig.4 PCA analysis of utilization of soil microbial carbon sources 96 h after 3 applications of 10 mg/kg dimethomorph

由图3可知，烯酰吗啉含量为5 mg/kg时，PCA分析共提取了2个主成分，即PC1和PC2，二者的累积方差贡献率为100%，其中PC1的累积方差贡献率为73.396%，水平上分布了25种碳源，其中碳水化合物10种，氨基酸类和多聚物各3种，羧酸类5种，酚酸和胺类各2种；PC2上分布了6种碳源。

图4显示，烯酰吗啉含量为10 mg/kg时，PCA分析共提取了PC1和PC2 2个主成分，二者的累积方差贡献率为100%，其中PC1的累积方差贡献率为77.831%，水平上分布了25种碳源，其中碳水化合物10种，氨基酸和羧酸类各4种，多聚物3种，酚酸和胺类各2种；PC2水平上分布了6种碳源。

图5显示，烯酰吗啉含量为25 mg/kg时，PCA分析共提取出PC1和PC2 2个主成分，二者的累积方差贡献率为100%，PC1和PC2分别反映了碳源变异的61.328%和38.672%，其中PC1水平上分布了20种碳源，包括碳水化合物8种，氨基酸6种，羧酸和胺类各2种，酚酸和多聚物各1种；PC2水平上分布了11种碳源。说明施用烯酰吗啉后明显改变了土壤微生物的碳源利用方式以及土壤微生物群落结构。

图5 25 mg/kg烯酰吗啉施用3次处理土壤温育96 h的微生物碳源利用PCA结果Fig.5 PCA analysis of utilization of soil microbial carbon sources 96 h after 3 applications of 25 mg/kg dimethomorph

3 讨 论

本研究结果表明，施用7 d，低含量(5 mg/kg)烯酰吗啉对土壤呼吸强度有一定促进作用，高含量(10～25 mg/kg)烯酰吗啉对土壤呼吸强度有抑制作用。随着施用时间的延长，与CK相比，烯酰吗啉对土壤呼吸总体有明显的抑制作用。Chen等[26]发现，杀菌剂对土壤呼吸强度的抑制程度可达到30%～50%，Silva等[27]发现这种抑制作用不超过50%。本研究中，在试验恢复期，5～25 mg/kg烯酰吗啉对土壤呼吸强度的抑制作用一直存在，其原因可能是杀菌剂的长期高频施用对土壤微生物存在一定的毒害作用，抑制了土壤微生物活动，甚至杀死土壤微生物，从而导致土壤呼吸强度减弱。

本研究中，前两次施用5，10 mg/kg烯酰吗啉后对土壤微生物多样性指标影响不显著；第3次施用5，10 mg/kg烯酰吗啉后，随着土壤中烯酰吗啉的积累，Shannon物种丰富度指数和McIntosh指数与CK相比总体显著降低，而Simpson优势度指数无显著变化。表明多次施用低含量烯酰吗啉累积对土壤微生物群落物种丰富度以及均一度存在不同程度的抑制作用。这与Yu等[28]和王秀国等[29]的研究结果类似。不论是第1次、第2次施用还是第3次施用，与CK相比，25 mg/kg含量的烯酰吗啉处理土壤Shannon物种丰富度指数、Simpson优势度指数以及McIntosh指数总体显著降低。可见，不论施用几次，高含量烯酰吗啉对土壤微生物的胁迫作用明显，微生物多样性受到显著抑制，这与张超等[30]的结论一致。其原因可能是高含量烯酰吗啉杀死了土壤真菌，使土壤微生物数量减少，增加了细菌的代谢活性，相应地降低了病原真菌以及真菌分泌物带来的影响。

本研究中，在第1次施用后，低含量(5，10 mg/kg)烯酰吗啉污染对土壤AWCD值影响较小，高含量(25 mg/kg)烯酰吗啉对土壤AWCD值影响明显，对土壤微生物的代谢活性有明显抑制作用；在第2次和第3次施用后，与CK相比，无论是低含量还是高含量，烯酰吗啉处理土壤AWCD值总体显著减小，烯酰吗啉对土壤微生物代谢活性的抑制作用增强。本研究结果表明，施用烯酰吗啉改变了土壤微生物利用碳源的能力及土壤微生物群落结构；随着施用次数的增加，土壤微生物对碳水化合物等碳源的利用率逐渐增加，对羧酸和酚酸类碳源的利用率逐渐下降，表明烯酰吗啉的施用明显影响了土壤微生物群落的碳源利用方式。邵元元等[31]证实了百菌清对某些单一碳源代谢具有明显的抑制作用。Ibekwe等[32]研究证实，土壤熏蒸剂能够显著改变土壤微生物群落的功能多样性。其原因是碳水化合物类碳源能够直接参与到微生物的生命活动中，更容易被利用。同时，被杀死的细菌和真菌也可作为碳源促进土壤其他微生物的生长。

4 结 论

1)烯酰吗啉对土壤呼吸强度总体有明显的抑制作用，且其含量越高、施用次数越多，抑制作用越强。

2)多次施用低含量(5，10 mg/kg)烯酰吗啉累积对土壤微生物群落物种丰富度以及均一度存在不同程度的抑制作用；而高含量(25 mg/kg)烯酰吗啉不论施用几次，均会对土壤微生物群落多样性产生显著的抑制作用。

3)在第1次施用后，只有高含量(25 mg/kg)烯酰吗啉对土壤AWCD值影响明显，对土壤微生物的代谢活性有明显抑制作用；在第2次和第3次施用后，无论是低含量(5，10 mg/kg)还是高含量(25 mg/kg)，烯酰吗啉处理土壤AWCD值总体显著减小，表明其对土壤微生物代谢活性的抑制作用显著增强。

4)施用烯酰吗啉影响了土壤微生物碳源利用方式和土壤微生物群落结构，其中土壤微生物对碳水化合物类碳源利用率明显增大。

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